วิธีการทางพันธุศาสตร์โมเลกุลเพื่อการวินิจฉัยโรคทางพันธุกรรม

วิธีการทางเทคโนโลยี DNA ใช้เพื่อระบุตำแหน่งของยีนกลายพันธุ์ในโครโมโซมเฉพาะ ซึ่งเป็นสาเหตุของการเกิดโรคทางพันธุกรรมบางรูปแบบ เนื่องจากยีนเป็นส่วนหนึ่งของ DNA และการกลายพันธุ์ของยีนคือความเสียหายต่อโครงสร้างหลักของ DNA (การกลายพันธุ์หมายถึงการเปลี่ยนแปลงทั้งหมดในลำดับ DNA โดยไม่คำนึงถึงตำแหน่งและผลกระทบต่อความสามารถในการมีชีวิตอยู่ของบุคคล) ดังนั้น การตรวจสอบการเตรียมโครโมโซมเมตาเฟสของผู้ป่วยที่เป็นโรคทางพันธุกรรมจึงสามารถระบุตำแหน่งของยีนที่ทำให้เกิดโรคได้ วิธีการทางพันธุศาสตร์ระดับโมเลกุลสร้างโอกาสในการวินิจฉัยโรคในระดับโครงสร้าง DNA ที่เปลี่ยนแปลงไป ทำให้เราสามารถระบุตำแหน่งของความผิดปกติทางพันธุกรรมได้ วิธีการทางพันธุศาสตร์ระดับโมเลกุลสามารถระบุการกลายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกับการแทนที่เบสเพียงตัวเดียวได้

ขั้นตอนที่สำคัญที่สุดในการระบุยีนคือการแยก DNA สามารถแยกได้จากเนื้อเยื่อและเซลล์ทุกชนิดที่มีนิวเคลียส ขั้นตอนการแยก DNA ได้แก่ การสลายเซลล์อย่างรวดเร็ว การแยกชิ้นส่วนของออร์แกเนลล์และเยื่อหุ้มเซลล์ออกด้วยการปั่นเหวี่ยง การทำลายโปรตีนด้วยเอนไซม์และการสกัดจากสารละลายโดยใช้ฟีนอลและคลอโรฟอร์ม การทำให้โมเลกุล DNA เข้มข้นขึ้นโดยการตกตะกอนในเอธานอล

ในห้องปฏิบัติการทางพันธุกรรม มักจะแยก DNA ออกจากเม็ดเลือดขาว โดยจะนำเลือดดำของผู้ป่วย 5-20 มล. ใส่ในหลอดทดลองที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วพร้อมสารละลายป้องกันการแข็งตัวของเลือด (เฮปาริน) จากนั้นจึงแยกเม็ดเลือดขาวและประมวลผลตามขั้นตอนข้างต้น

ขั้นตอนต่อไปในการเตรียมวัสดุสำหรับการวิจัยคือการ "ตัด" DNA ออกเป็นชิ้นเล็กชิ้นน้อยในพื้นที่ที่มีลำดับเบสที่เฉพาะเจาะจงอย่างเคร่งครัด ซึ่งดำเนินการโดยใช้เอนไซม์แบคทีเรีย - เอนไซม์ตัดจำเพาะ (เอนไซม์ตัดจำเพาะ) เอนไซม์ตัดจำเพาะจะจดจำลำดับเฉพาะของนิวคลีโอไทด์ 4-6 ตัว หรือน้อยกว่านั้นคือ 8-12 ตัวในโมเลกุล DNA สองสาย และแบ่งมันออกเป็นชิ้นเล็กชิ้นน้อยที่ตำแหน่งของลำดับเหล่านี้ ซึ่งเรียกว่าไซต์ตัดจำเพาะ จำนวนของชิ้นส่วนตัดจำเพาะของ DNA ที่เกิดขึ้นนั้นถูกกำหนดโดยความถี่ของการเกิดขึ้นของไซต์ตัดจำเพาะ และขนาดของชิ้นส่วนนั้นถูกกำหนดโดยลักษณะของการกระจายของไซต์เหล่านี้ตามความยาวของโมเลกุล DNA ดั้งเดิม ยิ่งไซต์ตัดจำเพาะอยู่มากเท่าไร ชิ้นส่วน DNA หลังจากการจำกัดจำเพาะก็จะยิ่งสั้นลงเท่านั้น ปัจจุบัน เอนไซม์ตัดจำเพาะที่มีต้นกำเนิดจากแบคทีเรียมีมากกว่า 500 ชนิดที่รู้จัก และเอนไซม์เหล่านี้แต่ละตัวจะจดจำลำดับนิวคลีโอไทด์เฉพาะของตัวเอง ในอนาคต ไซต์จำกัดยีนสามารถใช้เป็นเครื่องหมายทางพันธุกรรมของดีเอ็นเอได้ ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นจากการจำกัดยีนสามารถเรียงลำดับตามความยาวได้โดยใช้อิเล็กโทรโฟรีซิสในเจลอะกาโรสหรือโพลีอะคริลาไมด์ ดังนั้นจึงสามารถกำหนดน้ำหนักโมเลกุลของชิ้นส่วนได้ โดยทั่วไป ดีเอ็นเอในเจลจะถูกระบุโดยการย้อมสีเฉพาะ (โดยปกติคือเอทิดิอัมโบรไมด์) และการส่องเจลในแสงอัลตราไวโอเลตที่ส่งผ่าน ไซต์ของตำแหน่งดีเอ็นเอจะมีสีแดง อย่างไรก็ตาม ในมนุษย์ เมื่อดีเอ็นเอถูกประมวลผลด้วยเอนไซม์จำกัดยีนหลายตัว ชิ้นส่วนที่มีความยาวต่างกันจำนวนมากจะถูกสร้างขึ้นจนไม่สามารถแยกออกได้ด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิส กล่าวคือ ไม่สามารถระบุชิ้นส่วนดีเอ็นเอแต่ละชิ้นด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสได้ด้วยสายตา (จะได้การย้อมสีที่สม่ำเสมอตลอดความยาวทั้งหมดของเจล) ดังนั้น เพื่อระบุชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ต้องการในเจลดังกล่าว จึงใช้วิธีไฮบริดิเซชันด้วยโพรบดีเอ็นเอที่มีฉลากติดไว้

ส่วนที่แยกเดี่ยวของ DNA หรือ RNA สามารถจับกับสายคู่ได้ (hybridizing) โดยที่กัวนีนจะจับกับไซโทซีนเสมอ และอะดีนีนจะจับกับไทมีน นี่คือวิธีการสร้างโมเลกุลสายคู่ หากสำเนาสายเดี่ยวของยีนโคลนถูกติดฉลากด้วยฉลากกัมมันตภาพรังสี ก็จะได้โพรบ โพรบนี้สามารถค้นหาส่วนที่แยกเดี่ยวของ DNA ได้ ซึ่งจากนั้นจะระบุได้ง่ายโดยใช้ออโตราดิโอแกรม โพรบกัมมันตภาพรังสีที่เพิ่มเข้าไปในการเตรียมโครโมโซมที่ยืดออกทำให้สามารถระบุตำแหน่งยีนบนโครโมโซมเฉพาะได้ โดยใช้โพรบ DNA สามารถระบุพื้นที่เฉพาะได้ระหว่างการบล็อตเซาเทิร์น ไฮบริดิเซชันจะเกิดขึ้นหากส่วน DNA ที่กำลังทดสอบมียีนปกติ ในกรณีที่มีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ผิดปกติ กล่าวคือ โครงสร้างโครโมโซมที่สอดคล้องกันมียีนกลายพันธุ์ ไฮบริดิเซชันจะไม่เกิดขึ้น ซึ่งทำให้สามารถระบุตำแหน่งของยีนที่ทำให้เกิดโรคได้

เพื่อให้ได้โพรบ DNA จะใช้วิธีการโคลนยีน สาระสำคัญของวิธีการนี้คือ การแทรกชิ้นส่วน DNA ที่สอดคล้องกับยีนหรือส่วนหนึ่งของยีนเข้าไปในอนุภาคโคลน ซึ่งโดยปกติแล้วจะเป็นพลาสมิดแบคทีเรีย (DNA นอกโครโมโซมรูปวงแหวนที่มีอยู่ในเซลล์แบคทีเรียและมียีนที่ดื้อต่อยาปฏิชีวนะ) จากนั้นจึงขยายพันธุ์แบคทีเรียที่มีพลาสมิดที่มียีนมนุษย์ที่แทรกเข้าไป ด้วยกระบวนการสังเคราะห์ในพลาสมิด จึงสามารถได้สำเนาของยีนมนุษย์หรือส่วนหนึ่งของยีนมนุษย์ได้เป็นพันล้านชุด

สำเนา DNA ที่ได้ซึ่งติดฉลากด้วยสารกัมมันตรังสีหรือฟลูออโรโครม จะถูกนำไปใช้เป็นโพรบเพื่อค้นหาลำดับที่เสริมกันในกลุ่มโมเลกุล DNA ที่ศึกษา

ในปัจจุบันมีวิธีการต่างๆ มากมายที่ใช้โพรบ DNA เพื่อวินิจฉัยการกลายพันธุ์ของยีน

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]