การวินิจฉัยวัณโรคด้วยห้องปฏิบัติการ

วัณโรคเป็นโรคที่วินิจฉัยได้ง่ายในสภาวะปัจจุบันและด้วยความสำเร็จทางวิทยาศาสตร์ การวินิจฉัยวัณโรคในห้องปฏิบัติการถือเป็นวิธีการวินิจฉัยที่สำคัญรองจากวิธีการตรวจด้วยเอกซเรย์เท่านั้น

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

การตรวจเลือดทางคลินิก

ในผู้ป่วยวัณโรค การเปลี่ยนแปลงในการทดสอบเลือดทั่วไปไม่บ่งชี้โรค ในวัณโรคที่มีขอบเขตจำกัดและมีฤทธิ์น้อย เม็ดเลือดแดงมีสีผิดปกติแต่มีจำนวนปกติเป็นลักษณะเฉพาะ ในผู้ป่วยที่มีการแพร่กระจายของเชื้อจำนวนมากหรือปอดบวมที่มีการอักเสบของต่อมน้ำเหลืองที่มีการอักเสบเป็นวงกว้าง ความเสียหายของลำไส้เฉพาะ รวมถึงมีเลือดออกในปอดหรือหลังผ่าตัดจำนวนมาก เม็ดเลือดแดงต่ำและเม็ดเลือดแดงเล็ก อาจพบภาวะเม็ดเลือดแดงมากเกินปกติและเม็ดเลือดแดงมากเกินปกติได้ พบภาวะเม็ดเลือดแดงมากเกินปกติและโดยเฉพาะอย่างยิ่งภาวะเม็ดเลือดแดงมากเกินปกติน้อยกว่ามาก โดยปกติจะพบในโรคโลหิตจางรุนแรง จำนวนเรติคูโลไซต์ในระยะชดเชยของวัณโรคจะแตกต่างกันไปตั้งแต่ 0.1 ถึง 0.6% ในระยะชดเชยย่อยจะแตกต่างกันไปตั้งแต่ 0.6 ถึง 1.0% และในระยะชดเชย 1% ของเรติคูโลไซต์เป็นลักษณะเฉพาะ

ในบางกรณีของโรควัณโรค อาจพบเม็ดเลือดขาวสูงปานกลาง (มากถึง 15,000 เม็ดเลือดขาว) แต่พบน้อยคือ เม็ดเลือดขาวต่ำ โดยเกิดขึ้น 2-7% ในผู้ป่วยที่เป็นโรคในรูปแบบจำกัดและไม่รุนแรง และ 12.5% ในผู้ป่วยวัณโรคปอดแบบทำลายล้างและลุกลาม

ส่วนใหญ่มักเกิดการเปลี่ยนแปลงในสูตรของเม็ดเลือดขาว โดยสังเกตได้ว่าเป็นทั้งนิวโทรฟิลแบบสัมพัทธ์และแบบสัมบูรณ์ โดยสูตรของเม็ดเลือดขาวจะเลื่อนไปทางซ้ายเล็กน้อยไปยังพรอมัยโลไซต์ ไมอีโลไซต์พบได้น้อยมากในกรณีของวัณโรคที่ไม่มีภาวะแทรกซ้อน การเพิ่มขึ้นของจำนวนนิวโทรฟิลที่มีเม็ดเลือดผิดปกติในฮีโมแกรมของผู้ป่วยวัณโรคมักจะบ่งบอกถึงระยะเวลาของกระบวนการนี้ ในผู้ป่วยวัณโรครุนแรง นิวโทรฟิลเกือบทั้งหมดจะมีเม็ดเลือดผิดปกติ เมื่อการระบาดของวัณโรคทุเลาลง การเปลี่ยนแปลงของนิวโทรฟิลจะกลับมาเป็นปกติค่อนข้างเร็ว เม็ดเลือดผิดปกติของนิวโทรฟิลมักจะคงอยู่นานกว่าการเปลี่ยนแปลงอื่นๆ ในฮีโมแกรม

ปริมาณอีโอซิโนฟิลในเลือดส่วนปลายยังผันผวนขึ้นอยู่กับระยะของกระบวนการและภาวะภูมิแพ้ของสิ่งมีชีวิต จำนวนอีโอซิโนฟิลจะลดลงจนกลายเป็นภาวะเอนีโอซิโนฟิลในกรณีที่โรคกำเริบรุนแรงและยาวนาน และในทางกลับกัน จำนวนจะเพิ่มขึ้นเมื่อสารแทรกซึมและน้ำในช่องเยื่อหุ้มปอดถูกดูดซึมกลับ รวมถึงในวัณโรคระยะเริ่มต้น

วัณโรคชนิดปฐมภูมิส่วนใหญ่มักมาพร้อมกับภาวะลิมโฟไซต์ต่ำ ซึ่งบางครั้งอาจพบอาการนี้นานหลายปีแม้ว่าจะมีแผลเป็นจากการเปลี่ยนแปลงบางอย่างแล้วก็ตาม วัณโรคชนิดทุติยภูมิในระยะเฉียบพลัน อาจมาพร้อมกับจำนวนลิมโฟไซต์ปกติหรือลิมโฟไซต์ต่ำก็ได้ ขึ้นอยู่กับความรุนแรงของกระบวนการ

ในบรรดาการทดสอบเพื่อประเมินกระบวนการวัณโรค การตรวจอัตราการตกตะกอนของเม็ดเลือดแดง (ESR) ถือเป็นการตรวจที่สำคัญมาก เนื่องจาก ESR มีความสำคัญในการประเมินกระบวนการวัณโรคและระบุรูปแบบที่ออกฤทธิ์ ค่า ESR ที่เพิ่มขึ้นบ่งชี้ถึงการมีอยู่ของกระบวนการทางพยาธิวิทยา (การติดเชื้อและการอักเสบ การเป็นหนอง การติดเชื้อในกระแสเลือด การเกิดเม็ดเลือดขาวชนิดลิมโฟแกรนูโลมาโตซิส เป็นต้น) และทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ความรุนแรงของโรค แต่ค่า ESR ปกติไม่ได้บ่งชี้เสมอไปว่าไม่มีพยาธิวิทยา การตกตะกอนของเม็ดเลือดแดงเร็วขึ้นเนื่องจากการเพิ่มขึ้นของปริมาณโกลบูลิน ไฟบริโนเจน คอเลสเตอรอลในเลือด และความหนืดของเลือดลดลง การตกตะกอนของเม็ดเลือดแดงช้าลงเป็นลักษณะเฉพาะของภาวะที่มีความเข้มข้นของเลือดเพิ่มขึ้น ปริมาณอัลบูมินและกรดน้ำดีเพิ่มขึ้น

ผลการตรวจเลือดของผู้ป่วยวัณโรคจะเปลี่ยนแปลงไปในระหว่างการรักษา ยิ่งการแทรกแซงการรักษาประสบความสำเร็จมากเท่าไร การเปลี่ยนแปลงทางโลหิตวิทยาก็จะหายเร็วขึ้นเท่านั้น ในขณะเดียวกัน ควรคำนึงถึงผลของยาต้านแบคทีเรียต่างๆ ต่อการสร้างเม็ดเลือด ยาเหล่านี้มักทำให้เกิดภาวะอีโอซิโนฟิล ในบางกรณีอาจเกิดภาวะเม็ดเลือดขาวสูง และมักเกิดภาวะเม็ดเลือดขาวต่ำจนถึงภาวะเม็ดเลือดขาวต่ำและภาวะ lymphoid-reticular reaction การติดตามผลทางโลหิตวิทยาอย่างเป็นระบบและการวิเคราะห์ข้อมูลที่ได้รับอย่างถูกต้องถือเป็นสิ่งสำคัญในการประเมินสภาพทางคลินิกของผู้ป่วย พลวัตของกระบวนการ และประสิทธิผลของการรักษา

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

การวิเคราะห์ปัสสาวะทางคลินิก

ในกรณีของวัณโรคทางเดินปัสสาวะ การตรวจปัสสาวะเป็นวิธีการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการหลัก อาจพบภาวะเม็ดเลือดขาวในปัสสาวะ ภาวะเม็ดเลือดแดงในปัสสาวะ ภาวะโปรตีนในปัสสาวะ ภาวะไอโซสทีนูเรีย วัณโรคในปัสสาวะ และภาวะแบคทีเรียในปัสสาวะแบบไม่จำเพาะ

ภาวะเม็ดเลือดขาวสูงในปัสสาวะเป็นอาการที่พบบ่อยที่สุดของวัณโรคทางเดินปัสสาวะก่อนการให้เคมีบำบัดโดยเฉพาะ และจะไม่ปรากฏเฉพาะในกรณีพิเศษ เช่น การอุดตันของท่อไตอย่างสมบูรณ์ การทดสอบของ Nechiporenko (การกำหนดจำนวนเม็ดเลือดขาวในปัสสาวะ 1 มล.) จะช่วยให้ประเมินระดับของภาวะเม็ดเลือดขาวสูงในปัสสาวะในวัณโรคไตได้อย่างเป็นรูปธรรมมากขึ้น และในบางกรณีสามารถตรวจพบได้ด้วยการวิเคราะห์ปัสสาวะทั่วไปตามปกติ อย่างไรก็ตาม ควรคำนึงไว้ด้วยว่าภาวะเม็ดเลือดขาวสูงในปัสสาวะอาจเกิดขึ้นได้ในไตอักเสบเฉียบพลันและเรื้อรัง กระเพาะปัสสาวะอักเสบ ท่อปัสสาวะอักเสบ นิ่วในไต และท่อไต

ภาวะเม็ดเลือดแดงในปัสสาวะ เช่นเดียวกับภาวะเม็ดเลือดขาวในปัสสาวะ ถือเป็นอาการทางห้องปฏิบัติการที่พบบ่อยที่สุดอย่างหนึ่งของวัณโรคทางเดินปัสสาวะและอวัยวะสืบพันธุ์ ความถี่ของภาวะเลือดออกในปัสสาวะขึ้นอยู่กับความชุกของกระบวนการนี้ โดยจะเพิ่มขึ้นตามกระบวนการทำลายล้างวัณโรคในไต ภาวะเม็ดเลือดแดงในปัสสาวะโดยไม่มีเม็ดเลือดขาวในปัสสาวะมักพบในวัณโรคไตระยะเริ่มต้น ภาวะเม็ดเลือดแดงในปัสสาวะซึ่งพบมากกว่าภาวะเม็ดเลือดขาวในปัสสาวะเป็นเหตุผลสำคัญที่สนับสนุนวัณโรคไตเมื่อต้องแยกแยะจากไตอักเสบจากเชื้อแบคทีเรีย

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

การตรวจเลือดทางชีวเคมี

ในวัณโรค การเปลี่ยนแปลงของดัชนีทางชีวเคมีบางอย่างขึ้นอยู่กับระยะของกระบวนการ ภาวะแทรกซ้อน และโรคต่างๆ ที่เกิดขึ้นร่วมกันเป็นหลัก ในผู้ป่วยวัณโรคปอดและอวัยวะอื่นๆ ที่ไม่แสดงอาการ โปรตีนทั้งหมดและเศษส่วนโปรตีนในซีรั่มเลือดจะไม่เปลี่ยนแปลงและกำหนดปริมาณปกติของโปรตีนเหล่านั้น

ในรูปแบบเฉียบพลันของโรค ตลอดจนการกำเริบและการดำเนินไปของวัณโรคเรื้อรัง ค่าสัมประสิทธิ์อัลบูมิน-โกลบูลินจะลดลง

การตรวจระดับบิลิรูบินโดยตรงและทั้งหมด แอสพาร์เทตอะมิโนทรานสเฟอเรส (AST) และอะลานีนอะมิโนทรานสเฟอเรส (ALT) ในซีรั่มเลือดนั้นมีความสำคัญอย่างยิ่งในการประเมินสถานะการทำงานและความเสียหายของสารอินทรีย์ต่อตับในโรควัณโรคและภาวะแทรกซ้อน การตรวจระดับอะมิโนทรานสเฟอเรสแบบไดนามิก บิลิรูบินในการรักษาผู้ป่วยวัณโรค โดยเฉพาะในรูปแบบที่รุนแรง เป็นส่วนประกอบที่จำเป็นของการตรวจทางชีวเคมีของผู้ป่วยวัณโรค และจะดำเนินการเป็นประจำทุกเดือน

การประเมินสถานะการทำงานของไตประกอบด้วยการตรวจวัดค่าครีเอตินินในซีรั่มและการคำนวณอัตราการกรองของไตโดยใช้สูตร Cockcroft-Gault การคำนวณอัตราการกรองของไตโดยใช้การทดสอบ Reberg ให้ผลลัพธ์ที่แม่นยำน้อยกว่า

เป้าหมายหลักของการศึกษาด้านชีวเคมีแบบไดนามิกของผู้ป่วยวัณโรคคือการติดตามการดำเนินของกระบวนการ การตรวจจับผลข้างเคียงของยาอย่างทันท่วงที และการแก้ไขภาวะสมดุลภายในที่เกิดใหม่อย่างเหมาะสม

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

การประยุกต์ใช้วิธีการวิจัยทางชีวเคมีในวัณโรคนอกปอด

ตัวบ่งชี้ที่มีข้อมูลมากที่สุดถือเป็นปริมาณกรดวัณโรคในของเหลวในร่างกาย อย่างไรก็ตาม การกำหนดปริมาณกรดวัณโรคมีความเกี่ยวข้องกับความยากลำบากทางเทคนิค (ความจำเป็นในการใช้แก๊สโครมาโทกราฟีและแมสสเปกโตรเมตรี)

การวัดกิจกรรมของเอนไซม์อะดีโนซีนดีอะมิเนสซึ่งตรวจพบในของเหลวในเยื่อหุ้มข้อ เยื่อหุ้มหัวใจ ช่องท้อง หรือไขสันหลังนั้นมีแนวโน้มที่ดี ผู้ผลิตเอนไซม์อะดีโนซีนดีอะมิเนสหลักคือลิมโฟไซต์และโมโนไซต์ การกำหนดกิจกรรมของเอนไซม์อะดีโนซีนดีอะมิเนสในของเหลวในร่างกายจะช่วยให้วินิจฉัยโรคเยื่อหุ้มข้ออักเสบ วัณโรคต่อมน้ำเหลือง เยื่อหุ้มสมองอักเสบ และซีโรไซติสได้ง่ายขึ้น

ตัวบ่งชี้ทางชีวเคมีบางตัวเนื่องจากไม่มีความจำเพาะจึงถูกกำหนดในของเหลวในร่างกายที่อยู่ใกล้กับรอยโรคเท่านั้น ระดับของตัวบ่งชี้จะวัดตามการตอบสนองต่อการให้ทูเบอร์คูลินใต้ผิวหนังหรือในชั้นหนัง (โดยปกติจะวัดก่อนการให้ยาและ 48 และ 72 ชั่วโมงหลังจากนั้น) หลังจากนั้น จะคำนวณระดับการเพิ่มขึ้นของระดับเครื่องหมาย (เป็นเปอร์เซ็นต์) เทียบกับระดับเริ่มต้น

ในทางที่ดีที่สุด กิจกรรมของเอนไซม์เฉพาะอวัยวะทรานซามิดิเนสจะถูกตรวจสอบในปัสสาวะ โดยสังเกตได้จากความเสียหายของไตจากสาเหตุต่างๆ การศึกษาทรานซามิดิเนสนั้นมีเหตุผลเพียงพอในเงื่อนไขการให้ทูเบอร์คูลินใต้ผิวหนังเพื่อให้กระบวนการอักเสบในบริเวณนั้นรุนแรงขึ้น กิจกรรมของทรานซามิดิเนสจะถูกตรวจสอบในปัสสาวะในขั้นต้นและ 24-72 ชั่วโมงหลังจากให้ทูเบอร์คูลิน 50 TE การเพิ่มขึ้นของการหมักในปัสสาวะ 2 เท่าหรือมากกว่านั้นทำให้สามารถแยกความแตกต่างระหว่างวัณโรคไตที่ยังคงมีอยู่กับการกำเริบของโรคไตอักเสบเรื้อรังได้ใน 82% ของกรณี

ในกรณีของวัณโรคของอวัยวะสืบพันธุ์สตรี ความเข้มข้นของแฮปโตโกลบินและมาโลนไดอัลดีไฮด์ในเลือดจะถูกกำหนดภายใต้เงื่อนไขการทดสอบทูเบอร์คูลินแบบกระตุ้น ทูเบอร์คูลินจะถูกฉีดเข้าใต้ผิวหนังด้วยขนาดยา 50 TE และทำการศึกษาทางชีวเคมีซ้ำหลังจากผ่านไป 72 ชั่วโมง ในกรณีของสาเหตุของวัณโรค ระดับของแฮปโตโกลบินจะเพิ่มขึ้นอย่างน้อย 28% และระดับมาโลนไดอัลดีไฮด์จะอยู่ที่ 39% หรือมากกว่านั้น การกำหนดกิจกรรมของอะดีโนซีนดีอะมิเนสในของเหลวในช่องท้องที่ได้จากถุงดักลาสก็ใช้เช่นกัน การเจาะจะถูกตรวจสอบอีกครั้งหลังจากผ่านไป 72 ชั่วโมงหลังจากการฉีดทูเบอร์คูลินเข้าชั้นผิวหนังด้วยขนาดยา 0.1 TE และ 0.01 TE ในบริเวณที่ยื่นออกมาของอวัยวะสืบพันธุ์ภายในบนผนังหน้าท้องด้านหน้า การเพิ่มขึ้นของกิจกรรมของ adenosine deaminase 10% หรือมากกว่าเมื่อเทียบกับค่าเริ่มต้น บ่งชี้ถึงกระบวนการวัณโรค

ในกรณีที่เกิดความเสียหายต่อดวงตา จะต้องตรวจสอบปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นในดวงตาเพื่อตอบสนองต่อการกระตุ้นของแอนติเจน ในกรณีนี้ การพัฒนาของการตอบสนองที่แสดงออกอย่างชัดเจนพร้อมกับการลดลงของการทำงานของการมองเห็นเป็นสิ่งที่ไม่พึงประสงค์ เนื่องจากการประเมินปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นเพียงเล็กน้อยมักทำได้ยาก จึงขอแนะนำให้เน้นที่ระดับการเพิ่มขึ้นของแฮปโตโกลบินหรืออะดีโนซีนดีอะมิเนสในซีรั่มเลือดควบคู่กันเพื่อสรุปผล

การศึกษาด้านชีวเคมีทั้งหมดควรดำเนินการร่วมกับวิธีการอื่นๆ

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

การศึกษาเกี่ยวกับระบบการแข็งตัวของเลือด

ความเกี่ยวข้องของการศึกษาสถานะของระบบการแข็งตัวของเลือดในวิทยาการปอดเกิดจากการมีเลือดไหลออกจากปอดหรือเลือดออกในปอดในผู้ป่วยวัณโรคปอดหลายราย รวมถึงภาวะแทรกซ้อนจากการแข็งตัวของเลือดในวัณโรคที่ผ่าตัดรักษา นอกจากนี้ การแข็งตัวของเลือดในหลอดเลือดแฝงที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติยังส่งผลต่อการดำเนินของโรคและประสิทธิภาพของเคมีบำบัดอีกด้วย

ในผู้ป่วยวัณโรคปอดที่มีการอักเสบจากสารคัดหลั่งเป็นส่วนใหญ่ พบว่าฤทธิ์ต้านการแข็งตัวของเลือดลดลง ในผู้ป่วยที่ปอดได้รับความเสียหายเพียงเล็กน้อยและมีการอักเสบจากสารคัดหลั่งเป็นส่วนใหญ่ พบว่าการแข็งตัวของเลือดในหลอดเลือดมีน้อยมาก ในผู้ป่วยวัณโรคปอดที่มีอาการไอเป็นเลือดและมีเลือดออกในปอด สภาวะของระบบการแข็งตัวของเลือดจะแตกต่างกัน ในผู้ป่วยที่เสียเลือดเล็กน้อยในช่วงที่ไอเป็นเลือดมากที่สุดหรือทันทีหลังจากหยุดเลือด พบว่าความสามารถในการแข็งตัวของเลือดเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วเนื่องจากกระบวนการสร้างธรอมบินเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในขณะที่ยังคงความสามารถในการแข็งตัวของเลือด "เชิงโครงสร้าง" เพิ่มขึ้น ในผู้ป่วยที่เสียเลือดมาก พบว่าศักยภาพในการแข็งตัวของเลือดลดลงเนื่องจากความเข้มข้นของไฟบริโนเจน กิจกรรมของแฟกเตอร์ XIII และจำนวนเกล็ดเลือดลดลง ในระยะของการรักษาทางศัลยกรรมในผู้ป่วยวัณโรคปอดชนิดจำกัด ความผิดปกติที่สำคัญของระบบโฮมีโอสตาซิสจะไม่เกิดขึ้น ในผู้ป่วยที่มีกระบวนการต่างๆ อย่างกว้างขวาง เมื่อทำการผ่าตัดเอาปอดออกหรือการผ่าตัดเยื่อหุ้มปอดออก มักจะเกิดกลุ่มอาการ DIC ซึ่งอาจกลายเป็น "โรคที่สอง" ได้

เพื่อตรวจติดตามสถานะของระบบการแข็งตัวของเลือดในผู้ป่วยวัณโรคปอด จำเป็นต้องกำหนดเวลาการทำงานของลิ่มเลือดบางส่วน (APTT) ไฟบริโนเจน เวลาของธรอมบิน ดัชนีโปรทรอมบิน ตลอดจนเวลาในการออกเลือดและเวลาในการแข็งตัวของเลือด

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

การศึกษาเกี่ยวกับฮอร์โมน

การทดลองทางคลินิกและการทดลองสมัยใหม่บ่งชี้ถึงการเปลี่ยนแปลงของสถานะฮอร์โมนในการอักเสบของวัณโรคเฉพาะที่ในปอด ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าการแก้ไขความผิดปกติของระบบต่อมใต้สมอง-ต่อมหมวกไต ต่อมใต้สมอง-ต่อมไทรอยด์ และการทำงานของตับอ่อนร่วมกับการบำบัดวัณโรคมีส่วนช่วยกระตุ้นการสร้างไฟโบรเจเนซิสและกระบวนการซ่อมแซมในจุดที่มีการอักเสบเฉพาะ

สถานะการทำงานของระบบต่อมใต้สมอง-ต่อมไทรอยด์จะตัดสินจากปริมาณของไตรไอโอโดไทรโอนีน (T3) ไทรอกซิน (T4) และฮอร์โมนกระตุ้นต่อมไทรอยด์ (TSH) ในซีรั่มเลือด ได้_รับการ_{ยืนยัน ว่าพบภาวะไทรอยด์ทำงานน้อยแบบไม่แสดงอาการ}ในผู้ป่วยวัณโรคปอด 38-45% และส่วนใหญ่มักวินิจฉัยในรูปแบบแพร่กระจายและเนื้อเยื่อพังผืด-โพรง ในรูปแบบเหล่านี้ ระดับของทั้ง T3 และ T4 จะลดลงอย่างรวดเร็วที่สุดและ_ความไม่สมดุลของฮอร์โมนเหล่านี้เกิดขึ้นในรูปแบบของการเพิ่มขึ้นของ_{อัตราส่วน} T4 _/ T3

การทำงานของต่อมหมวกไตจะถูกประเมินโดยระดับคอร์ติซอลในซีรั่ม และการทำงานของต่อมไร้ท่อของตับอ่อนจะถูกประเมินโดยความเข้มข้นของอินซูลินที่ตอบสนองต่อภูมิคุ้มกัน ในระยะเฉียบพลันของโรคติดเชื้อ ความต้องการคอร์ติซอลและอินซูลินในร่างกายจะเพิ่มขึ้น ภาวะอินซูลินในเลือดสูงยังบ่งชี้ถึงภาวะดื้อต่ออินซูลินของเนื้อเยื่อร่างกาย ซึ่งเป็นเรื่องปกติสำหรับกระบวนการอักเสบใดๆ โดยเฉพาะกระบวนการเฉพาะ การกำหนดหน้าที่ของกลูโคคอร์ติคอยด์ของต่อมหมวกไตในวัณโรคปอดที่มีอาการรุนแรงช่วยให้เราตรวจพบภาวะคอร์ติคอยด์ในเลือดสูงในผู้ป่วยส่วนใหญ่ได้ ความเข้มข้นของคอร์ติซอลในเลือดปกติในผู้ป่วยที่มีการอักเสบจากการติดเชื้อในระยะเฉียบพลันควรพิจารณาว่าเป็นความไม่เพียงพอของหน้าที่ของกลูโคคอร์ติคอยด์ในต่อมหมวกไต ซึ่งสามารถใช้เป็นพื้นฐานสำหรับการบำบัดทดแทนด้วยกลูโคคอร์ติคอยด์ในปริมาณที่เหมาะสม

ผู้ป่วยวัณโรคปอดเกือบหนึ่งในสามมีระดับอินซูลินในเลือดต่ำจนเกือบถึงเกณฑ์ปกติ ขณะที่ร้อยละ 13-20 มีระดับอินซูลินในเลือดสูงอย่างมีนัยสำคัญ ทั้งภาวะอินซูลินต่ำและอินซูลินสูงสัมพันธ์กันเป็นปัจจัยเสี่ยงสูงต่อการเกิดความผิดปกติของการเผาผลาญคาร์โบไฮเดรตที่มีความรุนแรงแตกต่างกัน การเปลี่ยนแปลงในกิจกรรมการทำงานของเซลล์บีของตับอ่อนเหล่านี้ต้องได้รับการตรวจติดตามระดับน้ำตาลในเลือดอย่างสม่ำเสมอในผู้ป่วยวัณโรคและการป้องกันโรคเบาหวานอย่างทันท่วงที นอกจากนี้ ยังถือเป็นเหตุผลเพิ่มเติมสำหรับความเหมาะสมในการใช้อินซูลินในปริมาณที่เหมาะสมในการรักษาโรควัณโรคแบบซับซ้อน

โดยทั่วไประดับฮอร์โมนไทรอยด์ลดลง ความไม่สมดุลของฮอร์โมน ภาวะคอร์ติซอลในเลือดสูง และภาวะอินซูลินในเลือดสูง มักพบมากที่สุดในผู้ป่วยที่มีอาการของโรควัณโรคขั้นรุนแรง มีรอยโรคที่ปอดอย่างกว้างขวาง และมีอาการพิษวัณโรคอย่างชัดเจน

การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยาของโรควัณโรค

การศึกษาด้านจุลชีววิทยาเป็นสิ่งจำเป็นในการระบุตัวผู้ป่วยวัณโรค การยืนยันการวินิจฉัย การติดตามและแก้ไขการให้เคมีบำบัด การประเมินผลการรักษา กล่าวอีกนัยหนึ่ง คือ นับตั้งแต่ช่วงเวลาที่ผู้ป่วยวัณโรคได้รับการลงทะเบียนจนกระทั่งผู้ป่วยถูกลบออกจากทะเบียน

โครงการและโปรแกรมด้านระบาดวิทยาทั้งหมดนั้นขึ้นอยู่กับการประเมินจำนวนแบคทีเรียที่ขับถ่ายออกมา ซึ่งไม่สามารถทำได้โดยไม่ต้องใช้วิธีการทางห้องปฏิบัติการในการตรวจหาเชื้อวัณโรค เมื่อตรวจสอบความน่าสนใจของประชากรที่เรียกว่าไม่ได้จัดระเบียบ พบว่าเปอร์เซ็นต์ของแบคทีเรียที่ขับถ่ายออกมาจะสูงถึง 70 เปอร์เซ็นต์หรือมากกว่านั้น ซึ่งทำให้วิธีการทางห้องปฏิบัติการเป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพพอสมควรในการระบุผู้ป่วยวัณโรคในกลุ่มประชากรนี้

วิธีการทางจุลชีววิทยาแบบดั้งเดิมในการวินิจฉัยวัณโรคคือการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์และวัฒนธรรม วิธีการสมัยใหม่ได้แก่ การเพาะเชื้อไมโคแบคทีเรียมวัณโรคในระบบอัตโนมัติและ PCR อย่างไรก็ตาม วิธีการเหล่านี้ทั้งหมดจำเป็นต้องใช้ร่วมกับวิธีการทางแบคทีเรียวิทยาแบบคลาสสิก

การรวบรวมวัสดุการวินิจฉัย

ประสิทธิภาพของการทดสอบในห้องปฏิบัติการขึ้นอยู่กับคุณภาพของวัสดุที่ใช้ในการวินิจฉัยเป็นส่วนใหญ่ การปฏิบัติตามกฎเกณฑ์ในการรวบรวม จัดเก็บ และขนส่งวัสดุที่ใช้ในการวินิจฉัย และการนำอัลกอริธึมการตรวจผู้ป่วยไปใช้อย่างถูกต้องแม่นยำ ส่งผลโดยตรงต่อผลลัพธ์และรับประกันความปลอดภัยทางชีวภาพ

วัสดุต่างๆ ถูกนำมาใช้เพื่อทดสอบวัณโรค เนื่องจากวัณโรคปอดเป็นรูปแบบการติดเชื้อวัณโรคที่พบบ่อยที่สุด วัสดุหลักสำหรับการทดสอบจึงถือเป็นเสมหะและสารคัดหลั่งจากหลอดลมและหลอดลมส่วนอื่นๆ: สารคัดหลั่งจากทางเดินหายใจส่วนบนที่ได้จากการสูดดมละอองฝอย: น้ำจากการล้างหลอดลม การล้างหลอดลมและถุงลม; วัสดุที่ได้จากการส่องกล้องตรวจหลอดลม การตรวจชิ้นเนื้อผ่านหลอดลมและปอด: สารคัดหลั่งจากหลอดลม สารคัดหลั่งจากกล่องเสียง สารคัดหลั่งจากบาดแผล ฯลฯ

ประสิทธิผลของการวิจัยจะเพิ่มขึ้นหากมีการเก็บตัวอย่างวัสดุจากผู้ป่วยอย่างมีการควบคุม เพื่อจุดประสงค์นี้ จึงมีการจัดสรรห้องที่มีอุปกรณ์พิเศษหรือซื้อห้องพิเศษ การเก็บตัวอย่างวัสดุเป็นขั้นตอนที่อันตราย ดังนั้นจึงต้องเก็บตัวอย่างสำหรับการวิจัยโดยปฏิบัติตามกฎความปลอดภัยด้านการติดเชื้อ

วัตถุดิบสำหรับการทดสอบเชื้อ Mycobacterium tuberculosis จะถูกเก็บรวบรวมไว้ในขวดที่ผ่านการฆ่าเชื้อพร้อมฝาเกลียวแน่นเพื่อป้องกันการปนเปื้อนของสิ่งแวดล้อมและปกป้องวัตถุดิบที่เก็บรวบรวมจากการปนเปื้อน

ขวดสำหรับเก็บวัสดุการวินิจฉัยต้องเป็นไปตามข้อกำหนดต่อไปนี้:

• จะต้องทำจากวัสดุที่ทนทานต่อแรงกระแทก
• ควรละลายได้ง่ายเมื่อผ่านการนึ่งด้วยไอน้ำ
• มีปริมาตรเพียงพอ (40-50 มล.):
• มีช่องเปิดสำหรับรวบรวมเสมหะกว้าง (เส้นผ่านศูนย์กลางไม่น้อยกว่า 30 มม.)
• ง่ายต่อการจัดการ โปร่งใสหรือโปร่งแสง เพื่อให้ประเมินปริมาณและคุณภาพของตัวอย่างที่เก็บได้โดยไม่ต้องเปิดฝา

เพื่อให้ได้ผลการวิจัยที่ดีที่สุด จะต้องปฏิบัติตามเงื่อนไขต่อไปนี้:

• การเก็บตัวอย่างวัสดุควรดำเนินการก่อนเริ่มการให้เคมีบำบัด
• ต้องเก็บรวบรวมข้อมูลก่อนรับประทานอาหารหรือรับประทานยาในตอนเช้า
• สำหรับการศึกษาควรเก็บตัวอย่างเสมหะในตอนเช้าอย่างน้อย 3 ตัวอย่าง โดยเก็บเสมหะติดต่อกัน 3 วัน
• วัสดุที่เก็บรวบรวมจะต้องส่งมอบถึงห้องปฏิบัติการโดยเร็วที่สุด:
• ในกรณีที่ไม่สามารถนำส่งวัสดุถึงห้องปฏิบัติการได้ทันที ให้เก็บไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิอากาศ 4 °C ไม่เกิน 48 ชั่วโมง
• ในการขนส่งวัสดุจำเป็นต้องใส่ใจเป็นพิเศษกับความสมบูรณ์ของขวด

เสมหะที่เก็บมาอย่างถูกต้องจะมีลักษณะเป็นเมือกหรือเป็นหนอง ปริมาณเสมหะที่เหมาะสมในการตรวจคือ 3-5 มล.

การเก็บเสมหะจะต้องอยู่ภายใต้การดูแลของเจ้าหน้าที่สาธารณสุข ผู้ที่รับผิดชอบการเก็บเสมหะจะต้องปฏิบัติตามกฎเกณฑ์บางประการ:

• จำเป็นต้องอธิบายให้ผู้ป่วยทราบถึงจุดประสงค์ของการตรวจ และความจำเป็นในการไอออกมาไม่ใช่เพียงน้ำลายหรือเมือกโพรงจมูก แต่รวมถึงสิ่งที่อยู่ในส่วนลึกของทางเดินหายใจด้วย ซึ่งอาจเกิดจากการไอมีเสมหะหลังจากหายใจเข้าลึกๆ หลายครั้ง (2-3 ครั้ง) นอกจากนี้ จำเป็นต้องเตือนผู้ป่วยด้วยว่าก่อนอื่นต้องล้างปากด้วยน้ำต้มสุกเพื่อกำจัดจุลินทรีย์ที่เจริญเติบโตอยู่ในช่องปากและเศษอาหารที่ทำให้การตรวจเสมหะยุ่งยาก
• บุคลากรทางการแพทย์ที่เกี่ยวข้องกับการเก็บเสมหะ นอกจากจะต้องสวมชุดคลุมและหมวกแล้ว จะต้องสวมหน้ากากอนามัย ถุงมือยาง และผ้ากันเปื้อนยางด้วย
• เมื่อยืนอยู่ด้านหลังผู้ป่วย แพทย์แนะนำให้ถือขวดให้ชิดริมฝีปากของผู้ป่วยมากที่สุดเท่าที่จะทำได้ และรีบตักเสมหะออกมาทันทีที่ผู้ป่วยไอออกมา โดยต้องแน่ใจว่าอากาศไหลเวียนออกจากบุคลากรทางการแพทย์:
• เมื่อเก็บเสมหะเสร็จแล้ว เจ้าหน้าที่สาธารณสุขควรปิดฝาขวดอย่างระมัดระวังและประเมินปริมาณและคุณภาพของเสมหะที่เก็บได้ จากนั้นติดฉลากขวดและใส่ไว้ในกล่องพิเศษสำหรับขนส่งไปยังห้องปฏิบัติการ

หากผู้ป่วยไม่หลั่งเสมหะ ในคืนก่อนหน้าและเช้าตรู่ของวันที่เก็บตัวอย่าง ควรให้ยาขับเสมหะ: สารสกัดจากรากมาร์ชเมลโลว์ (มิวคัลทิน) บรอมเฮกซีน แอมบรอกโซล ฯลฯ หรืออาจใช้วิธีสูดดมที่ระคายเคือง โดยใช้อุปกรณ์ที่ติดตั้งในห้องเก็บตัวอย่างเสมหะ วัสดุที่เก็บตัวอย่างด้วยวิธีนี้จะไม่ถูกเก็บรักษาและควรได้รับการตรวจสอบในวันเก็บตัวอย่าง เพื่อหลีกเลี่ยงการ "ปฏิเสธ" ในห้องปฏิบัติการ ควรระบุหมายเหตุพิเศษในการส่งตัวผู้ป่วย

หากไม่ได้ทำการศึกษาด้านจุลชีววิทยาในสถาบันใดสถาบันหนึ่ง วัสดุวินิจฉัยที่รวบรวมได้จะต้องส่งไปยังห้องปฏิบัติการส่วนกลาง โดยต้องเก็บวัสดุไว้ในตู้เย็นหรือในสารกันบูดระหว่างการจัดส่ง วัสดุจะต้องส่งไปยังห้องปฏิบัติการในกล่องขนส่งที่สามารถฆ่าเชื้อได้ง่าย ตัวอย่างแต่ละชิ้นจะต้องมีฉลากที่เหมาะสม และต้องมีแบบฟอร์มที่แนบมากับตัวอย่างทั้งหมด

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

วิธีการและความถี่ในการตรวจผู้ป่วย

ในการตรวจวินิจฉัยผู้ป่วยวัณโรคเบื้องต้นนั้น จำเป็นต้องตรวจเสมหะอย่างน้อย 3 ส่วนที่เก็บมาภายใต้การดูแลของบุคลากรทางการแพทย์ตลอดระยะเวลา 2 หรือ 3 วัน ซึ่งจะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของกล้องจุลทรรศน์

การตรวจคัดกรองวัณโรคเบื้องต้นควรดำเนินการโดยสถาบันทางการแพทย์และการวินิจฉัยทั้งหมดของระบบการดูแลสุขภาพ เมื่อไม่นานมานี้ เพื่อเพิ่มประสิทธิผลของการตรวจเบื้องต้น จึงได้จัดตั้งศูนย์ที่เรียกว่าศูนย์กล้องจุลทรรศน์ขึ้นโดยอาศัยห้องปฏิบัติการวินิจฉัยทางคลินิกที่มีกล้องจุลทรรศน์และอุปกรณ์ที่ทันสมัยเพื่อให้มั่นใจถึงความปลอดภัยในช่วงการระบาด

สถาบันต่อต้านวัณโรคใช้แผนสำรวจที่กำหนดให้ตรวจเสมหะหรือวัสดุวินิจฉัยอื่นๆ อย่างน้อย 3 ครั้งภายใน 3 วัน ในระหว่างการรักษา จะมีการศึกษาจุลชีววิทยาอย่างสม่ำเสมออย่างน้อยเดือนละครั้งในระยะเคมีบำบัดเข้มข้น เมื่อเข้าสู่ระยะติดตามผล จะมีการศึกษาน้อยลง โดยเว้นระยะห่าง 2-3 เดือน ในขณะที่ความถี่ของการศึกษาจะลดลงเหลือ 2 ครั้ง

ลักษณะเด่นของการเก็บตัวอย่างวัสดุเพื่อการวินิจฉัยโรควัณโรคนอกปอด

ลักษณะเด่นของวัสดุทางพยาธิวิทยาในวัณโรคชนิดนอกปอดคือมีเชื้อไมโคแบคทีเรีย ทูเบอร์คูโลซิส ความเข้มข้นต่ำ ซึ่งต้องใช้วิธีการวิจัยทางจุลชีววิทยาที่ละเอียดอ่อนกว่า โดยส่วนใหญ่จะใช้วิธีการหว่านบนอาหารที่มีสารอาหารเป็นหลัก

ในกรณีของวัณโรคทางเดินปัสสาวะ ปัสสาวะเป็นวัสดุที่เข้าถึงได้มากที่สุดสำหรับการตรวจ ควรให้พยาบาลที่ได้รับการฝึกอบรมเป็นพิเศษเป็นผู้เก็บปัสสาวะ

ล้างอวัยวะสืบพันธุ์ภายนอกด้วยน้ำและสบู่หรือสารละลายโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนตเจือจาง ตรวจดูช่องเปิดภายนอกของท่อปัสสาวะอย่างระมัดระวัง เก็บปัสสาวะตอนเช้าช่วงกลางในขวดที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว โดยในผู้ชายจะเก็บปัสสาวะตามธรรมชาติ ส่วนในผู้หญิงจะใช้สายสวนปัสสาวะ เก็บปัสสาวะจากอุ้งเชิงกรานของไตในหลอดทดลองที่ผ่านการฆ่าเชื้อระหว่างการใส่สายสวนไตหนึ่งหรือสองข้าง โดยในกรณีหลังนี้จะต้องแยกจากไตแต่ละข้าง ปัสสาวะส่วนนี้จะถูกปั่นเหวี่ยงเล็กน้อย จากนั้นจึงตรวจสอบตะกอน

ในผู้ชาย อสุจิ การเจาะอัณฑะ และสารคัดหลั่งของต่อมลูกหมากจะถูกปั่นเพื่อแยกตะกอน การนวดต่อมลูกหมากสามารถกระตุ้นการปล่อยสารคัดหลั่งที่มีเชื้อวัณโรคในผู้ชายได้หากตรวจพบบริเวณอวัยวะเพศ

เลือดประจำเดือนจะถูกเก็บรวบรวมจากผู้หญิงโดยการดูดหรือใช้หมวกคาฟกา วัสดุที่ได้จะถูกแยกออกจากเม็ดเลือดแดงโดยการล้างด้วยน้ำกลั่นแล้วปั่นเหวี่ยง จากนั้นตรวจสอบตะกอน

การระบายออกจากช่องปากมดลูกจะถูกเก็บรวบรวมไว้ในภาชนะหรือฝาคาฟคา นั่นคือควรสะสมวัสดุทางพยาธิวิทยาไว้ 1-2 มิลลิลิตร

วัสดุที่ได้รับระหว่างการผ่าตัดไต อวัยวะเพศ การตรวจชิ้นเนื้อ การขูดเยื่อบุโพรงมดลูก จะถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน ในการทำเช่นนี้ จะต้องวางวัสดุลงในครกที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วบดให้ละเอียดด้วยกรรไกรที่ผ่านการฆ่าเชื้อ จากนั้นจึงเติมทรายแม่น้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อลงในสารแขวนลอยที่ได้ในปริมาณเท่ากับมวลของวัสดุ จากนั้นจึงเติมสารละลายโซเดียมคลอไรด์ไอโซโทนิก 0.5-1.0 มล. และบดทุกอย่างจนกลายเป็นก้อนเนื้อนิ่มด้วยการเติมสารละลายโซเดียมคลอไรด์ไอโซโทนิก (4-5 มล.) จากนั้นปล่อยให้ก้อนเนื้อตกตะกอนเป็นเวลา 1-1.5 นาที จากนั้นจึงตรวจสอบของเหลวส่วนบน

วัณโรคของกระดูกและข้อ การเจาะ (หนองจากฝี) ที่ได้จากเข็มฉีดยาที่ปราศจากเชื้อจะถูกใส่ลงในภาชนะที่ปราศจากเชื้อและส่งไปยังห้องปฏิบัติการทันที โดยใช้ปิเปตที่ปราศจากเชื้อซึ่งชุบด้วยสารละลายโซเดียมคลอไรด์ไอโซโทนิกที่ปราศจากเชื้อแล้วก่อนหน้านี้ จะนำหนอง 2-5 มล. ออกมา ใส่ลงในขวดที่มีเม็ดบีด และเติมสารละลายโซเดียมคลอไรด์ไอโซโทนิกอีก 2-3 มล. ปิดขวดด้วยจุกยางและเขย่าในเครื่องเขย่าเป็นเวลา 8-10 นาที ตรวจสอบสารแขวนลอยที่ทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน

ในกรณีของวัณโรคข้อเข่าเสื่อมแบบมีรูพรุน หนองจะถูกเก็บจากรูพรุน ของเหลวที่ไหลออกมากจะถูกเก็บรวบรวมโดยตรงในหลอดทดลอง ในกรณีที่มีของเหลวไหลออกน้อย ให้ล้างบริเวณรูพรุนด้วยสารละลายโซเดียมคลอไรด์ไอโซโทนิกที่ผ่านการฆ่าเชื้อ จากนั้นจึงนำของเหลวที่ไหลออกในหลอดทดลองหรือผ้าอนามัยที่แช่ในหนองไปตรวจ

วัสดุผ่าตัดที่ได้รับระหว่างการผ่าตัดกระดูกและข้ออาจประกอบด้วยก้อนเนื้อเน่าเปื่อยที่เป็นหนอง เม็ดเลือด เนื้อเยื่อแผลเป็น เนื้อเยื่อกระดูก เนื้อเยื่อเยื่อหุ้มข้อ และสารตั้งต้นอื่นๆ การประมวลผลจะดำเนินการเช่นเดียวกับในกรณีของวัณโรคไต

การตรวจทางจุลชีววิทยาของน้ำในข้อในสารละลายโซเดียมซิเตรต 3% (ในอัตราส่วน 1:1) เพื่อป้องกันการแข็งตัวของเลือด จะดำเนินการทันทีหลังจากการเจาะ

วัณโรคต่อมน้ำเหลือง หนองที่สกัดออกมาในระหว่างการเจาะต่อมน้ำเหลืองจะถูกตรวจสอบในลักษณะเดียวกับหนองจากฝี เนื้อเยื่อต่อมน้ำเหลืองที่ได้มาจากการผ่าตัดและการตรวจชิ้นเนื้อจะถูกตรวจสอบเช่นเดียวกับวัณโรคชนิดอื่น

การศึกษาอุจจาระเพื่อหาเชื้อ Mycobacterium tuberculosis นั้นดำเนินการได้น้อยมากเนื่องจากแทบไม่มีผลลัพธ์เชิงบวกเลย

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

กล้องจุลทรรศน์ของไมโคแบคทีเรีย

การส่องกล้องเสมหะเป็นวิธีที่ค่อนข้างรวดเร็ว ง่าย และราคาไม่แพง ซึ่งควรใช้กับทุกกรณีที่สงสัยว่าเป็นวัณโรค นอกจากนี้ การศึกษานี้ยังดำเนินการเพื่อประเมินประสิทธิภาพของเคมีบำบัดและเพื่อยืนยันการฟื้นตัวหรือการรักษาที่ล้มเหลวในกรณีที่ไม่มีผลการเพาะเชื้อ

การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์มี 2 วิธี คือ

• วิธีการกล้องจุลทรรศน์โดยตรง โดยที่เตรียมสเมียร์โดยตรงจากวัสดุสำหรับการวินิจฉัย
• วิธีการทางกล้องจุลทรรศน์ของตะกอนที่เตรียมจากวัสดุที่ผ่านการบำบัดด้วยสารปนเปื้อนเพื่อการวิจัยทางวัฒนธรรม

วิธีแรกใช้ในห้องปฏิบัติการที่ทำการศึกษาทางกล้องจุลทรรศน์เท่านั้น (ห้องปฏิบัติการวินิจฉัยทางคลินิกของเครือข่ายการแพทย์ทั่วไป)

ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดของการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์จะได้มาจากการทำให้สารวินิจฉัยเข้มข้นขึ้น (เช่น โดยการปั่นเหวี่ยง)

เพื่อตรวจหาเชื้อวัณโรคด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่มีความน่าจะเป็น 50% เสมหะ 1 มล. ต้องมีเซลล์จุลินทรีย์มากกว่า 5,000 เซลล์ เสมหะของผู้ป่วยวัณโรคปอดมักมีแบคทีเรียที่ทนกรดจำนวนมาก ซึ่งทำให้สามารถตรวจพบเชื้อเหล่านี้ได้อย่างน่าเชื่อถือด้วยการส่องกล้องตรวจเชื้อแบคทีเรีย ความไวในการวินิจฉัยของวิธีนี้สามารถเพิ่มได้โดยการตรวจตัวอย่างเสมหะหลายๆ ตัวอย่างจากผู้ป่วย 1 ราย ผลการตรวจด้วยกล้องตรวจเชื้อแบคทีเรียที่เป็นลบไม่ได้ตัดการวินิจฉัยวัณโรคออกไป เนื่องจากเสมหะของผู้ป่วยบางรายมีเชื้อวัณโรคน้อยกว่าที่สามารถตรวจพบด้วยกล้องจุลทรรศน์ได้ การเตรียมเสมหะที่ไม่ดีก็อาจเป็นสาเหตุของผลการตรวจด้วยกล้องตรวจเชื้อแบคทีเรียที่เป็นลบได้เช่นกัน

วิธีการที่ใช้กันทั่วไปในการตรวจหาเชื้อไมโคแบคทีเรียที่ทนกรดในสเมียร์คือการย้อม Ziehl-Neelsen วิธีนี้ใช้การแทรกซึมของคาร์บอลฟุคซินเข้าไปในเซลล์จุลินทรีย์ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ที่มีชั้นแว็กซ์-ลิปิด โดยให้ความร้อนและการกัดกร่อนอย่างแรงของฟีนอลควบคู่กัน การทำให้สเมียร์เปลี่ยนสีในภายหลังด้วยกรดซัลฟิวริก 25% หรือแอลกอฮอล์ไฮโดรคลอริก 3% จะทำให้โครงสร้างที่ไม่ทนกรดทั้งหมดเปลี่ยนสีไปด้วย องค์ประกอบที่เปลี่ยนสีแล้วในสเมียร์จะถูกย้อมด้วยเมทิลีนบลู 0.3% เชื้อไมโคแบคทีเรียไม่รับรู้สีอะนิลีนแบบทั่วไป ส่งผลให้เชื้อไมโคแบคทีเรียที่ทนกรดถูกย้อมเป็นสีแดงราสเบอร์รี่ และจุลินทรีย์และองค์ประกอบในเซลล์อื่นๆ ถูกย้อมเป็นสีน้ำเงิน

ในการตรวจสอบคราบเปื้อนตามวิธีของ Ziehl-Neelsen ให้ใช้กล้องจุลทรรศน์แบบสองตาที่มีเลนส์แบบจุ่ม (กำลังขยาย 90 หรือ 100 เท่า) และเลนส์ตาที่มีกำลังขยาย 7 หรือ 10 เท่า ตรวจสอบระยะการมองเห็น 100 ระยะ ซึ่งเพียงพอสำหรับการตรวจพบเชื้อไมโคแบคทีเรียชนิดเดียวในคราบเปื้อน หากผลการตรวจดังกล่าวเป็นลบ แนะนำให้ตรวจสอบระยะการมองเห็นอีก 200 ระยะเพื่อยืนยัน จากนั้นบันทึกผลการตรวจเพื่อระบุจำนวนเชื้อไมโคแบคทีเรียที่ทนกรด (AFB) ที่ตรวจพบ

นอกจากวิธีนี้แล้ว การย้อมฟลูออโรโครมยังใช้สำหรับกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง ซึ่งช่วยให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด การใช้วิธีนี้เพิ่มประสิทธิภาพของกล้องจุลทรรศน์ได้ 10-15% เมื่อไมโคแบคทีเรียได้รับการรักษาด้วยสีย้อมเรืองแสง (ออรามีน โรดามีน ฯลฯ) สารเหล่านี้จะจับกับโครงสร้างคล้ายขี้ผึ้งของเซลล์จุลินทรีย์ด้วย เมื่อเซลล์ที่ย้อมได้รับการฉายรังสีด้วยแหล่งกำเนิดแสงที่น่าตื่นเต้น (รังสีอัลตราไวโอเลตสเปกตรัมหนึ่ง) เซลล์จะเริ่มเรืองแสงสีส้มหรือสีแดงสดบนพื้นหลังสีดำหรือสีเขียวเข้ม เนื่องจากความสว่างและคอนทราสต์สูงของภาพที่มองเห็นได้ จึงสามารถลดการขยายภาพโดยรวมของกล้องจุลทรรศน์ลงได้ 4-10 เท่า ซึ่งจะขยายขอบเขตการมองเห็นและลดเวลาในการดูการเตรียมการ นอกจากนี้ เนื่องจากระยะชัดลึกที่มากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ จึงสามารถเพิ่มความสบายในการศึกษาได้

เมื่อใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ การดูสเมียร์ในบริเวณเดียวกันจะใช้เวลาน้อยกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงของสเมียร์ที่ย้อมตามวิธีของ Ziehl-Neelsen อย่างมาก หากนักจุลทรรศน์ดูสเมียร์ประมาณ 20-25 สเมียร์ในหนึ่งวันทำงาน เขาก็สามารถตรวจตัวอย่างได้มากกว่า 60-80 ตัวอย่างในเวลาเดียวกันด้วยความช่วยเหลือของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ นักจุลทรรศน์ที่มีประสบการณ์ทราบดีว่าการย้อมเซลล์ด้วยส่วนผสมของออรามีนและโรดามีนนั้นมีลักษณะเฉพาะบางประการสำหรับไมโคแบคทีเรียที่ทนกรด ซึ่งในกรณีนี้จะมีลักษณะเป็นแท่งสีทอง ซาโปรไฟต์จะย้อมเป็นสีเขียว

ข้อดีที่สำคัญอีกประการของวิธีการส่องกล้องจุลทรรศน์แบบเรืองแสงคือความสามารถในการตรวจพบไมโคแบคทีเรียที่เปลี่ยนแปลงไปซึ่งสูญเสียคุณสมบัติทนกรดภายใต้อิทธิพลของปัจจัยที่ไม่พึงประสงค์จำนวนหนึ่ง โดยเฉพาะการให้เคมีบำบัดอย่างเข้มข้น ดังนั้นจึงไม่สามารถตรวจพบได้ด้วยการย้อมสี Ziehl-Neelsen

ข้อเสียของการใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์คือค่าใช้จ่ายของกล้องจุลทรรศน์และการใช้งานที่ค่อนข้างสูง อย่างไรก็ตาม ในห้องปฏิบัติการส่วนกลางหรือห้องปฏิบัติการขนาดใหญ่ที่มีปริมาณงานเกินกว่ามาตรฐานที่ช่างเทคนิคห้องปฏิบัติการสามคนทำงานกับกล้องจุลทรรศน์แบบธรรมดาสามเครื่อง การใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์เพียงเครื่องเดียวจะมีราคาถูกกว่า

วิธีการตรวจแบคทีเรียด้วยกล้องจุลทรรศน์มีความจำเพาะค่อนข้างสูง (89-100%) ผลลัพธ์เชิงบวกประมาณ 97% ที่ได้จากวิธีการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ใดๆ ได้รับการยืนยันอย่างชัดเจนจากผลการหว่านเมล็ด

ควรสังเกตว่าการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ด้วยสเมียร์ของวัสดุที่ทำให้เกิดโรคไม่สามารถระบุชนิดของเชื้อไมโคแบคทีเรียที่ต้านทานกรดที่ตรวจพบได้ วิธีการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ช่วยให้สามารถสรุปได้เฉพาะการมีอยู่หรือไม่อยู่ของจุลินทรีย์ที่ต้านทานกรดในการเตรียม ซึ่งอธิบายได้จากการมีอยู่ของจุลินทรีย์ที่ต้านทานกรดที่ไม่ใช่เชื้อวัณโรคจำนวนมากในธรรมชาติที่มีสัณฐานวิทยาคล้ายคลึงกับเชื้อไมโคแบคทีเรียในกลุ่มวัณโรค

การประเมินผลการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์จะดำเนินการในหน่วยกึ่งเชิงปริมาณ

เพื่อให้สามารถเปรียบเทียบผลลัพธ์ของวิธีการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่แตกต่างกันได้ จะต้องมีการนำค่าสัมประสิทธิ์เชิงประจักษ์มาใช้ ตัวอย่างเช่น ในการเปรียบเทียบผลลัพธ์ของการทดสอบด้วยสีย้อมเรืองแสงกับข้อมูลของการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (กำลังขยาย 1,000 เท่า) จำเป็นต้องหารจำนวนไมโคแบคทีเรียที่ทนต่อกรดที่ตรวจพบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงด้วยค่าสัมประสิทธิ์ที่สอดคล้องกัน: ที่กำลังขยาย 250 เท่าของกล้องจุลทรรศน์ - 10, 450 เท่า - 4, 630 เท่า - 2

ลักษณะเด่นของกล้องจุลทรรศน์ในโรควัณโรคนอกปอด

ทำการส่องกล้องจุลทรรศน์โดยตรง รวมทั้งการส่องกล้องจุลทรรศน์ของคราบเปื้อนที่เตรียมหลังจากการเสริมสมรรถนะด้วยการย้อมตาม Ziehl-Neelsen หรือสีย้อมเรืองแสง การส่องกล้องจุลทรรศน์โดยตรงของคราบเปื้อนไม่มีประสิทธิภาพเนื่องจากความเข้มข้นต่ำของไมโคแบคทีเรียในวัสดุ ดังนั้นจึงสมเหตุสมผลมากกว่าที่จะใช้วิธีการเสริมสมรรถนะ การปั่นเหวี่ยงเป็นวิธีที่มีประสิทธิผลที่สุด หากวัสดุทางชีวภาพมีความหนืด ให้ใช้การปั่นเหวี่ยงพร้อมกับการทำให้วัสดุเป็นเนื้อเดียวกันและทำให้วัสดุเป็นของเหลวพร้อมกัน ซึ่งดำเนินการโดยใช้เครื่องปั่นเหวี่ยงความเร็วสูงที่มีแรงปั่นเหวี่ยง 3,000 กรัมและสารละลายไฮโปคลอไรต์ ปัจจุบันยังไม่มีการใช้วิธีการเสริมสมรรถนะอื่นๆ เช่น ไมโครฟลอเตชัน เนื่องจากการก่อตัวของละอองลอยที่เป็นอันตรายต่อสิ่งมีชีวิต

[ 37 ]

วิธีการเพาะเชื้อเพื่อวินิจฉัยโรควัณโรค

วิธีการเพาะเชื้อหรือวิธีการเพาะเชื้อมีความไวมากกว่าการส่องกล้องจุลทรรศน์แบบสเมียร์และมีข้อดีหลายประการเหนือกว่าวิธีหลัง โดยสามารถตรวจพบเชื้อไมโคแบคทีเรียที่มีชีวิตได้หลายสิบชนิดในวัสดุที่กำลังตรวจสอบ และมีประโยชน์ในการวินิจฉัยสูง ซึ่งมีความสำคัญอย่างยิ่งเมื่อตรวจวัสดุจากผู้ป่วยที่เพิ่งได้รับการวินิจฉัยหรือได้รับการรักษาซึ่งขับเชื้อไมโคแบคทีเรียออกมาจำนวนเล็กน้อย

เมื่อเทียบกับกล้องจุลทรรศน์ การวิจัยด้วยการเพาะเชื้อจะทำให้จำนวนผู้ป่วยวัณโรคที่ตรวจพบเพิ่มขึ้นมากกว่า 15-25% รวมถึงสามารถตรวจยืนยันวัณโรคได้ในระยะเริ่มต้นเมื่อโรคยังรักษาได้ง่าย ข้อดีที่สำคัญมากอย่างหนึ่งของการวิจัยด้วยการเพาะเชื้อคือสามารถเพาะเชื้อก่อโรคได้ ซึ่งสามารถระบุและศึกษาเกี่ยวกับความไวต่อยา ความรุนแรงของยา และคุณสมบัติทางชีวภาพอื่นๆ

ข้อเสียของวิธีการเพาะปลูก ได้แก่ ระยะเวลา (ระยะเวลาการรอคอยวัสดุถึง 10 สัปดาห์) ต้นทุนที่สูงขึ้น และความซับซ้อนในการประมวลผลวัสดุสำหรับการวินิจฉัย

หลักการในการบำบัดวัสดุวินิจฉัยก่อนหว่านเมล็ด

ไม่สามารถใช้การทดสอบวัณโรคด้วยวิธีทางจุลชีววิทยาทั่วไปได้ เนื่องจากเชื้อวัณโรคเติบโตช้ามาก และตัวอย่างทางคลินิกส่วนใหญ่มีจุลินทรีย์และเชื้อราที่เติบโตเร็วและเน่าเปื่อย การเจริญเติบโตอย่างรวดเร็วในอาหารที่มีสารอาหารอุดมสมบูรณ์จะขัดขวางการพัฒนาของเชื้อวัณโรคและไม่สามารถแยกเชื้อวัณโรคได้ ดังนั้นวัสดุที่ใช้ในการวินิจฉัยจะต้องได้รับการบำบัดล่วงหน้าก่อนหว่าน นอกจากนี้ เชื้อวัณโรคที่ปล่อยออกมาจากทางเดินหายใจของผู้ป่วยมักจะถูกล้อมรอบด้วยเมือกจำนวนมาก ซึ่งทำให้ยากต่อการทำให้เข้มข้น ในเรื่องนี้ ก่อนที่จะหว่านเสมหะและวัสดุอื่นๆ ที่คล้ายคลึงกัน จะต้องทำให้เป็นของเหลวและกำจัดสารปนเปื้อน

ผงซักฟอกและน้ำยาฆ่าเชื้อทุกชนิดมีผลเป็นพิษต่อเชื้อไมโคแบคทีเรียในระดับที่เห็นได้ชัดมากหรือน้อย ผลจากการบำบัด เชื้อไมโคแบคทีเรียอาจตายได้ถึง 90% เพื่อรักษาจำนวนเชื้อไมโคแบคทีเรียให้เพียงพอ จำเป็นต้องใช้วิธีการบำบัดที่อ่อนโยนซึ่งจะช่วยยับยั้งจุลินทรีย์ที่ทำให้เกิดโรคและเน่าเสียที่เติบโตเร็วได้ในขณะเดียวกันก็รักษาความสามารถในการดำรงอยู่ของเชื้อไมโคแบคทีเรียที่มีอยู่ในวัสดุให้ได้สูงสุด

ขึ้นอยู่กับวัสดุ ความสม่ำเสมอ และระดับการปนเปื้อน สารกำจัดสารปนเปื้อนต่างๆ จะถูกใช้สำหรับการบำบัดก่อนการหว่านเมล็ด สำหรับเสมหะ - สารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ 4% สารละลายไตรโซเดียมฟอสเฟต 10% เบนซัลโคเนียมคลอไรด์ไตรโซเดียมฟอสเฟต NALC-NaOH (N-acetyl-L-cysteine-โซเดียมไฮดรอกไซด์) ที่มีความเข้มข้นของ NaOH สุดท้าย 1% สำหรับปัสสาวะและวัสดุของเหลวอื่นๆ - สารละลายกรดซัลฟิวริก 3% สำหรับตัวอย่างที่ปนเปื้อน วัสดุที่มีไขมัน - สารละลายกรดออกซาลิกสูงสุด 5% นอกจากนี้ ในบางกรณี เอนไซม์และสารลดแรงตึงผิว (ผงซักฟอก) จะถูกนำมาใช้ การใช้ทวีนและผงซักฟอกอื่นๆ มาพร้อมกับการตายของเซลล์ไมโคแบคทีเรียที่น้อยกว่า (40-50% อยู่รอด) อย่างไรก็ตาม สามารถใช้ได้เฉพาะกับวัสดุของเหลวเท่านั้น NALC-NaOH ซึ่งผลิตเป็นชุด เป็นที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดในโลก วิธีนี้ช่วยให้แยกเซลล์ไมโคแบคทีเรียได้มากกว่า 85% การกำจัดสารปนเปื้อนจากเนื้อเยื่อแข็งทำได้ยากกว่า เนื่องจากยากต่อการคาดเดาระดับการกระจายตัวของสารในระหว่างการทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน ตัวอย่างเช่น การประมวลผลชิ้นเนื้อต่อมน้ำเหลืองมักมาพร้อมกับความถี่ที่เพิ่มขึ้นของการปนเปื้อนจากพืชต่างถิ่น ในกรณีนี้ สามารถใช้เอโทเนียม 1% ได้

วัสดุที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกันจะถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันโดยใช้ลูกปัดแก้วในสภาพที่มีสารปนเปื้อน วัสดุที่เป็นของเหลวจะถูกปั่นเหวี่ยงล่วงหน้าและประมวลผลเฉพาะตะกอนเท่านั้น

เทคนิคการเพาะและฟักไข่

หลังจากการประมวลผลเบื้องต้น วัสดุจะถูกปั่นเหวี่ยง ซึ่งจะทำให้ไมโคแบคทีเรียตกตะกอนและเพิ่มปริมาณในตะกอน ("การเพิ่มปริมาณตะกอน") ตะกอนที่ได้จะถูกทำให้เป็นกลางและฉีดสารเหลว (กึ่งเหลว) ลงบนพื้นผิวของสารอาหารหนาแน่นหรือหลอดทดลอง จากนั้นจึงเตรียมสเมียร์สำหรับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์จากตะกอนที่เหลือ เทคนิคการหว่านเมล็ดต้องป้องกันการปนเปื้อนข้ามของวัสดุวินิจฉัย

เพื่อให้การตีความทางคลินิกของผลการวิจัยด้านจุลชีววิทยาเชื่อถือได้ จะต้องปฏิบัติตามกฎดังต่อไปนี้: การศึกษาทางกล้องจุลทรรศน์และทางวัฒนธรรมจะต้องดำเนินการควบคู่กันจากตัวอย่างวัสดุวินิจฉัยเดียวกัน

หลอดทดลองที่เพาะเชื้อแล้วจะถูกวางไว้ในเทอร์โมสตัทที่อุณหภูมิ 37 ^องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 วันในตำแหน่งแนวนอน วิธีนี้จะช่วยให้วัสดุถูกดูดซึมเข้าไปในอาหารเลี้ยงเชื้อได้สม่ำเสมอมากขึ้น หลังจากผ่านไป 2 วัน หลอดทดลองจะถูกย้ายไปยังตำแหน่งแนวตั้งและปิดผนึกอย่างแน่นหนาด้วยจุกยางหรือซิลิโคนเพื่อป้องกันไม่ให้อาหารเลี้ยงเชื้อแห้ง

พืชผลจะถูกเก็บไว้ในเทอร์โมสตัทที่ 37 ^° C เป็นเวลา 10-12 สัปดาห์ โดยมีการตรวจสอบเป็นประจำทุกสัปดาห์ โดยจะบันทึกพารามิเตอร์ต่อไปนี้ในการตรวจสอบควบคุมแต่ละครั้ง:

• ระยะเวลาที่สังเกตเห็นการเจริญเติบโตได้ตั้งแต่วันที่หว่านเมล็ด
• อัตราการเจริญเติบโต (จำนวน CFU);
• การปนเปื้อนของวัฒนธรรมด้วยจุลินทรีย์หรือเชื้อราต่างประเทศ (เช่น หลอดทดลองถูกถอดออก)
• ไม่มีการเจริญเติบโตที่มองเห็นได้ หลอดจะถูกทิ้งไว้ในเทอร์โมสตัทจนกว่าจะมีการตรวจสอบครั้งต่อไป

สื่ออาหาร

สารอาหารต่างๆ ถูกนำมาใช้ในการเพาะเชื้อไมโคแบคทีเรีย ได้แก่ ของแข็ง กึ่งของเหลว ของเหลว อย่างไรก็ตาม สารอาหารที่ทราบกันดีนั้นไม่มีคุณสมบัติที่จะรับประกันการเติบโตของเซลล์ไมโคแบคทีเรียทั้งหมด ในเรื่องนี้ เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพ ขอแนะนำให้ใช้สารอาหาร 2-3 ชนิดที่มีองค์ประกอบต่างกันพร้อมกัน

องค์การอนามัยโลกแนะนำให้ใช้ Lowenstein-Jensen medium ซึ่งเป็นอาหารเลี้ยงเชื้อมาตรฐานสำหรับการแยกเชื้อก่อโรควัณโรคเบื้องต้นและการตรวจสอบความไวต่อยา ซึ่งเป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีความหนาแน่น โดยเชื้อไมโคแบคทีเรียจะเจริญเติบโตได้ในวันที่ 20-25 หลังจากการเพาะเชื้อที่ตรวจพบเชื้อวัณโรค การเพาะเชื้อที่ตรวจพบเชื้อวัณโรคต้องใช้ระยะเวลาฟักตัวนานกว่า (นานถึง 10-12 สัปดาห์)

ในประเทศของเรา อาหารเลี้ยงเชื้อ Finn-II ที่ ER Finn เสนอขึ้นนั้นได้รับความนิยมอย่างแพร่หลาย โดยอาหารเลี้ยงเชื้อนี้แตกต่างตรงที่แทนที่จะใช้ L-asparagine จะใช้โซเดียมกลูตาเมตแทน ซึ่งจะกระตุ้นกระบวนการอื่นในการสังเคราะห์กรดอะมิโนในไมโคแบคทีเรีย อาหารเลี้ยงเชื้อนี้เจริญเติบโตได้เร็วกว่าเล็กน้อย และความถี่ในการแยกไมโคแบคทีเรียนั้นสูงกว่าอาหารเลี้ยงเชื้อ Lowenstein-Jensen ถึง 6-8%

เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการวินิจฉัยทางแบคทีเรียวิทยาของวัณโรคนอกปอด ขอแนะนำให้รวม Finn-II media ที่ดัดแปลงแล้วเข้ากับสารอาหารเชิงซ้อน เพื่อเร่งการเจริญเติบโต โซเดียมไทโอไกลโคเลต 0.05% จะถูกใส่เพิ่มเติมลงในสารอาหาร Finn-II ซึ่งจะลดความเข้มข้นของออกซิเจน เพื่อปกป้องระบบเอนไซม์ของไมโคแบคทีเรียจากผลิตภัณฑ์ที่เป็นพิษของลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน จึงใส่ α-tocopherol acetate ซึ่งเป็นสารต้านอนุมูลอิสระลงในสารอาหาร Finn-II ในความเข้มข้น 0.001 μg/ml วัสดุสำหรับการวินิจฉัยจะถูกหว่านโดยใช้วิธีมาตรฐาน

ในห้องปฏิบัติการต่อต้านวัณโรคในรัสเซีย ยังมีการใช้สารอาหารหนาแน่นในรูปแบบอื่นๆ ด้วย เช่น สารอาหารชนิด "Novaya" ที่เสนอโดย GG Mordovsky สารอาหารชนิด A-6 และ A-9 ที่พัฒนาโดย VA Anikin เป็นต้น

เนื่องจากในระหว่างการทำเคมีบำบัด ระบบเผาผลาญต่างๆ ของเซลล์จุลินทรีย์จะได้รับความเสียหาย ประชากรไมโคแบคทีเรียบางส่วนจึงสูญเสียความสามารถในการเจริญเติบโตตามปกติบนสารอาหารทั่วไป และต้องใช้สารอาหารที่มีความสมดุลออสโมซิส (กึ่งของเหลวหรือของเหลว)

การประเมินและบันทึกผลการเพาะเชื้อวัสดุเพื่อการวินิจฉัย

เชื้อไมโคแบคทีเรียบางชนิดเติบโตช้า อาจเติบโตได้ภายใน 90 วัน จำนวนเชื้อไมโคแบคทีเรียเหล่านี้มีน้อย แต่จำเป็นต้องควบคุมอุณหภูมิในการปลูกเป็นเวลา 2.5-3 เดือน

เชื้อแบคทีเรีย Mycobacterium tuberculosis ที่ก่อโรคได้มักจะเติบโตบนอาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็งในรูปของกลุ่มแบคทีเรียชนิด R ที่มีขนาดและลักษณะแตกต่างกัน กลุ่มแบคทีเรียเหล่านี้มีลักษณะแห้ง ย่น มีสีงาช้าง และมีเม็ดสีเล็กน้อย บนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดอื่น กลุ่มแบคทีเรีย Mycobacterium tuberculosis อาจมีความชื้นมากกว่า หลังจากการทำเคมีบำบัดหรือระหว่างการรักษา อาจแยกกลุ่มแบคทีเรียที่เรียบแต่เติบโตชื้น (กลุ่ม S) ได้

ในการแยกวัฒนธรรม จะใช้ชุดการศึกษาพิเศษเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างไมโคแบคทีเรียชนิดวัณโรคกับไมโคแบคทีเรียชนิดไม่เป็นวัณโรค และซาโปรไฟต์ที่ทนกรด

คำตอบเชิงบวกจะได้รับหลังจากการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์บังคับของสเมียร์จากกลุ่มที่เติบโตซึ่งย้อมตาม Ziehl-Neelsen ในกรณีของการเจริญเติบโตของไมโคแบคทีเรีย จะพบแท่งสีแดงสดในสเมียร์ โดยนอนเดี่ยวๆ หรือเป็นกลุ่ม ก่อตัวเป็นกลุ่มในลักษณะของสักหลาดหรือถักเป็นเปีย ในวัฒนธรรมที่ยังอายุน้อย โดยเฉพาะที่แยกได้จากผู้ป่วยที่ได้รับการรักษาด้วยเคมีบำบัดเป็นเวลานาน ไมโคแบคทีเรียจะแยกแยะได้จากความหลากหลายที่ชัดเจน จนถึงการมีอยู่ของสายพันธุ์สั้น เกือบเป็นโคคอยด์ หรือยาวคล้ายไมซีเลียมเชื้อรา พร้อมกับรูปแบบแท่ง

ความเข้มข้นของการเติบโตของไมโคแบคทีเรียถูกกำหนดตามรูปแบบต่อไปนี้: (+) - 1-20 CFU ในหลอดทดลอง (การขับถ่ายแบคทีเรียต่ำ); (++) - 20-100 CFU ในหลอดทดลอง (การขับถ่ายแบคทีเรียปานกลาง); (+++) - >100 CFU ในหลอดทดลอง (การขับถ่ายแบคทีเรียมาก) ในการวินิจฉัยวัณโรคในห้องปฏิบัติการ การให้คำตอบที่ระบุว่าตรวจพบไมโคแบคทีเรียด้วยวิธีใดวิธีหนึ่งหรือไม่นั้นไม่เพียงพอ นอกจากนี้ ยังจำเป็นต้องมีความคิดโดยละเอียดเกี่ยวกับปริมาตรและลักษณะของประชากรไมโคแบคทีเรีย องค์ประกอบและคุณสมบัติของมัน ข้อมูลเหล่านี้จะช่วยให้ตีความสถานะของกระบวนการ วางแผนกลยุทธ์ และปรับการรักษาได้อย่างทันท่วงที

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มีการเสนอให้ใช้สารอาหารจากวุ้นที่มีสารเติมแต่งการเจริญเติบโตต่างๆ และการใช้ส่วนผสมของก๊าซพิเศษเพื่อเร่งการเติบโตของไมโคแบคทีเรีย เพื่อให้เกิดการเติบโตของไมโคแบคทีเรียบนอาหารเหล่านี้ จะต้องสร้างบรรยากาศที่มีคาร์บอนไดออกไซด์เพิ่มขึ้น (4-7%) ในระหว่างการเพาะเลี้ยง เพื่อจุดประสงค์นี้ จึงใช้ตู้เพาะเลี้ยง CO2 พิเศษ_{อย่างไรก็ตาม}ระบบเพาะเลี้ยงไมโคแบคทีเรียอัตโนมัติได้รับการพัฒนาสูงสุด ได้แก่ MGIT-BACTEC-960 และ MB/Bact

ระบบดังกล่าวระบบหนึ่งคือระบบ MGIT (mycobacteria growth indicator tube) ซึ่งเป็นการพัฒนาทางเทคโนโลยีขั้นสูงและได้รับการออกแบบมาเพื่อการวินิจฉัยวัณโรคทางแบคทีเรียวิทยาที่รวดเร็วยิ่งขึ้นและการตรวจสอบความไวของไมโคแบคทีเรียต่อยาชุดแรกและยาชุดที่สองบางชนิด MGIT ได้รับการออกแบบมาเพื่อใช้เป็นส่วนหนึ่งของอุปกรณ์ VASTEC-960 โดยจุลินทรีย์จะถูกเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองพิเศษที่มีสารอาหารเหลวตามสารอาหาร Middlebrook-7H9 ที่ดัดแปลง เพื่อกระตุ้นการเติบโตของไมโคแบคทีเรียและยับยั้งการเติบโตของจุลินทรีย์แปลกปลอม จึงมีการใช้ MGIT Growth Supplement และส่วนผสมของยาต้านแบคทีเรีย PANTA

การเจริญเติบโตของจุลินทรีย์จะถูกบันทึกด้วยแสง ซึ่งขึ้นอยู่กับการเรืองแสง ซึ่งเกิดขึ้นเมื่อไมโคแบคทีเรียกินออกซิเจนระหว่างการเจริญเติบโต สีย้อมฟลูออโรโครมที่ขึ้นอยู่กับออกซิเจนจะถูกบรรจุอยู่ที่ก้นหลอดทดลองพิเศษและปิดทับด้วยชั้นซิลิโคน การขยายพันธุ์ของไมโคแบคทีเรียทำให้ปริมาณออกซิเจนในหลอดทดลองลดลงและความเข้มข้นของออกซิเจนลดลง ซึ่งทำให้การเรืองแสงเพิ่มขึ้น ซึ่งจะมองเห็นได้เมื่อหลอดทดลองถูกฉายแสงอัลตราไวโอเลต และจะถูกบันทึกโดยอัตโนมัติโดยโฟโตเซนเซอร์ที่ติดตั้งอยู่ในอุปกรณ์ VASTES-960 ความเข้มของการเรืองแสงจะถูกบันทึกในหน่วยการเจริญเติบโต (GU) ข้อมูลการเจริญเติบโตจะถูกป้อนเข้าสู่คอมพิวเตอร์โดยอัตโนมัติ ซึ่งสามารถบันทึกข้อมูลได้ การวิเคราะห์เส้นโค้งการเจริญเติบโตด้วยคอมพิวเตอร์สามารถให้ข้อมูลเกี่ยวกับการปรากฏตัวของกลุ่มไมโคแบคทีเรียต่างๆ รวมถึงกลุ่มที่ไม่ใช่เชื้อวัณโรค และยังช่วยประเมินคุณสมบัติการเติบโตของไมโคแบคทีเรียได้อีกด้วย

จากการนำระบบดังกล่าวมาใช้ ทำให้ระยะเวลาในการเติบโตของเชื้อไมโคแบคทีเรียลดลงอย่างมาก โดยเฉลี่ยอยู่ที่ 11 วันสำหรับ VASTEC-960 และ 19 วันสำหรับ MB/Bact เมื่อเทียบกับ 33 วันสำหรับอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีสารอาหารหนาแน่นมาตรฐาน ทั้งนี้ ควรสังเกตว่าระบบเหล่านี้ต้องการบุคลากรที่มีคุณสมบัติสูง การหว่านวัสดุบนอาหารเลี้ยงเชื้อแบบของเหลวจำเป็นต้องทำควบคู่กับการหว่านบนอาหารเลี้ยงเชื้อ Lowenstein-Jensen ซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวสำรองในกรณีที่เชื้อไมโคแบคทีเรียวัณโรคไม่เติบโตบนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดอื่น

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

การตรวจสอบความไวต่อยาของเชื้อไมโคแบคทีเรีย

การกำหนดสเปกตรัมและระดับความไวของไมโคแบคทีเรียต่อยาต้านวัณโรคมีความสำคัญทางคลินิกอย่างยิ่ง เช่นเดียวกับการประเมินทางระบาดวิทยาของการแพร่กระจายของวัณโรคที่ดื้อยา นอกจากนี้ การติดตามการดื้อยาช่วยให้เราประเมินประสิทธิผลของโปรแกรมต่อต้านวัณโรคโดยรวมได้ โดยถือเป็นตัวบ่งชี้ที่สำคัญของการทำงานของส่วนประกอบทั้งหมดของมาตรการต่อต้านวัณโรค

ความถี่และกำหนดเวลาในการทดสอบความไวต่อยา:

• ก่อนเริ่มการรักษาครั้งหนึ่งเพื่อกำหนดกลยุทธ์และวิธีการรักษา:
• เมื่อแยกเชื้อจากวัสดุต่างๆ จากผู้ป่วย (เสมหะ BAL ปัสสาวะ สารคัดหลั่ง น้ำไขสันหลัง ฯลฯ) จะตรวจสอบสายพันธุ์ที่แยกได้ทั้งหมด:
• ในช่วงสุดท้ายของระยะการรักษาเข้มข้นโดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงทางคลินิกและทางรังสีวิทยา:
• หากมีความจำเป็นต้องเปลี่ยนรูปแบบการรักษาในกรณีดังต่อไปนี้:
  • ไม่มีเสมหะเป็นลบ
  • การเพาะเลี้ยงใหม่หลังจากผลเสมหะเป็นลบ
  • การเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของปริมาณ AFB ในสเมียร์หลังจากการลดลงในช่วงแรก เป็นที่ทราบกันดีว่าเชื้อ Mycobacterium tuberculosis ที่มีความไวต่อยาต่างกันจะถูกแยกออกจากวัสดุของผู้ป่วยที่เป็นวัณโรค ความไวของเชื้อต่อยาต้านวัณโรคอาจแตกต่างกันไปในสเปกตรัมของยา ระดับ ความถี่ และความเร็วในการพัฒนาของการดื้อยา

ระดับความต้านทานต่อยาของเชื้อ Mycobacterium tuberculosis จะพิจารณาตามเกณฑ์ที่กำหนด ซึ่งมุ่งเน้นที่ความสำคัญทางคลินิกของการต้านทาน และขึ้นอยู่กับฤทธิ์ต้านวัณโรคของยา เภสัชจลนศาสตร์ ความเข้มข้นในรอยโรค ขนาดยาสูงสุดในการรักษา เป็นต้น

ในปัจจุบันการตรวจสอบความไวต่อยาของไมโคแบคทีเรียมดำเนินการโดยใช้วิธีทางจุลชีววิทยา:

• ความเข้มข้นสัมบูรณ์ (วิธีการเจือจางในสารอาหารที่เป็นของแข็งหรือของเหลว)
• สัดส่วน,
• ค่าสัมประสิทธิ์ความต้านทาน

โดยทั่วไป ความต้านทานจะแสดงออกมาในรูปแบบของการเติบโตของกลุ่มแบคทีเรียไมโคแบคทีเรียทูเบอร์คูโลซิสที่สังเกตได้ด้วยสายตา อย่างไรก็ตาม มีวิธีการที่กระตุ้นให้เกิดการเติบโตในระยะเริ่มต้นของการแบ่งเซลล์ของแบคทีเรียไมโคแบคทีเรียในรูปแบบของปฏิกิริยาสี วิธีการเหล่านี้ช่วยลดระยะเวลาการทดสอบจาก 3-4 เหลือเพียง 2 สัปดาห์

วิธีการทำให้เข้มข้นโดยสมบูรณ์ซึ่งแนะนำโดยคณะกรรมการเคมีบำบัดขององค์การอนามัยโลกได้แพร่หลายในรัสเซียในฐานะวิธีการรวม จากมุมมองเชิงวิธีการ วิธีนี้เป็นวิธีที่ง่ายที่สุด แต่ต้องมีการกำหนดมาตรฐานและความแม่นยำของขั้นตอนในห้องปฏิบัติการสูง การทดสอบความไวต่อยาประกอบด้วยหลอดทดลองชุดหนึ่งที่มีสารอาหารที่ดัดแปลงด้วยยาต้านวัณโรค ชุดทดสอบประกอบด้วยหลอดทดลอง 2-3 หลอดที่มีความเข้มข้นของยาแต่ละชนิดที่แตกต่างกัน หลอดทดลองควบคุม 1 หลอดที่มีสารอาหารที่ไม่มียา และหลอดทดลอง 1 หลอดที่มีโซเดียมซาลิไซเลต 1,000 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตรหรือกรดพาราไนโตรเบนโซอิก 500 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร เพื่อตรวจจับการเติบโตของไมโคแบคทีเรียที่ไม่ใช่เชื้อวัณโรค

ในการเตรียมชุดสื่อที่มีการเตรียมการให้ใช้สื่อ Lowenstein-Jensen ที่ดัดแปลง (ไม่มีแป้ง) ซึ่งเทลงในขวด เติมยาต้านวัณโรคเจือจางในปริมาณที่กำหนดลงในขวดแต่ละขวด เนื้อหาในขวดจะถูกผสมให้เข้ากัน เทลงในหลอดทดลองและทำให้แข็งตัวในตำแหน่งเอียงเป็นเวลา 40 นาทีที่อุณหภูมิ 85 ° C แนะนำให้ทำให้สื่อแข็งตัวในเครื่องทำให้แข็งตัวไฟฟ้าที่มีการควบคุมอุณหภูมิอัตโนมัติ สื่อที่มียาต้านวัณโรค

แถวที่ 1 สามารถเก็บไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 2-4 องศาเซลเซียสได้ 1 เดือน ส่วนแถวที่ 2 สามารถเก็บยาได้ไม่เกิน 2 สัปดาห์ การเก็บรักษายาที่อุณหภูมิห้องนั้นไม่เป็นที่ยอมรับ เมื่อเตรียมสารละลายยาต้านวัณโรค จะต้องคำนึงถึงฤทธิ์ของสารละลาย โดยคำนวณความเข้มข้นโดยปรับตามน้ำหนักโมเลกุลของส่วนที่ไม่จำเพาะของยา ความบริสุทธิ์ ฯลฯ เพื่อตรวจสอบความไวต่อยา จะใช้เฉพาะสารบริสุทธิ์ทางเคมีเท่านั้น

หลักการของวิธีนี้คือการกำหนดความเข้มข้นของยาต้านวัณโรคที่ยับยั้งการเติบโตของประชากรไมโคแบคทีเรียจำนวนมาก หากดำเนินการอย่างถูกต้อง วิธีนี้จะเชื่อถือได้ดี

ก่อนทำการทดสอบ จำเป็นต้องตรวจสอบให้แน่ใจว่าเชื้อ Mycobacterium tuberculosis ที่แยกออกมาไม่มีจุลินทรีย์จากภายนอก เตรียมสารแขวนลอยที่เป็นเนื้อเดียวกันซึ่งประกอบด้วยจุลินทรีย์ 500 ล้านตัวใน 1 มล. (มาตรฐานความขุ่นของแสง 5 หน่วย) จากเชื้อ Mycobacterium ในสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.9% สารแขวนลอยที่ได้จะเจือจางด้วยสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.9% (1:10) และเติมสารแขวนลอย 0.2 มล. ลงในหลอดทดลองแต่ละหลอดของชุดสารอาหาร หลอดทดลองที่เพาะเชื้อแล้วจะถูกวางไว้ในเทอร์โมสตัทที่อุณหภูมิ 37 °C และวางไว้ในแนวนอนเป็นเวลา 2-3 วัน เพื่อให้พื้นผิวเอียงของสารอาหารได้รับการเพาะเชื้อ Mycobacterium tuberculosis อย่างสม่ำเสมอ จากนั้นย้ายหลอดทดลองไปยังตำแหน่งแนวตั้งและฟักเป็นเวลา 3-4 สัปดาห์ บันทึกผลหลังจาก 3-4 สัปดาห์

เนื่องจากเวลาในการแยกเชื้อก่อโรคจากวัสดุทางคลินิกบนอาหารเลี้ยงเชื้อนั้นต้องใช้เวลานานอย่างน้อย 1-1.5 เดือน จึงสามารถทราบผลการตรวจสอบความไวต่อยาโดยใช้วิธีนี้ได้ไม่เร็วกว่า 2-2.5 เดือนหลังจากเพาะวัสดุ ซึ่งเป็นข้อเสียเปรียบหลักประการหนึ่งของวิธีนี้

ผลการทดสอบความไวต่อยาของเชื้อไมโคแบคทีเรียจะตีความตามเกณฑ์บางประการ ในอาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็ง เชื้อจะถือว่าไวต่อความเข้มข้นของยาที่มีอยู่ในอาหารเลี้ยงเชื้อหากจำนวนกลุ่มเชื้อไมโคแบคทีเรียที่เพาะในหลอดทดลองที่มียาไม่เกิน 20 กลุ่ม โดยที่เชื้อจะเจริญมากในหลอดทดลองควบคุมที่ไม่มียา เชื้อจะถือว่าดื้อต่อความเข้มข้นที่กำหนดก็ต่อเมื่อมีกลุ่มเชื้อมากกว่า 20 กลุ่มเท่านั้น ในทางปฏิบัติ เมื่อได้ผลการเจริญเติบโตในหลอดทดลองที่มีปริมาณใกล้เคียงกับ 20 CFU จำเป็นต้องแจ้งหน่วยงานทางคลินิกว่าความไวหรือการดื้อยาในกรณีนี้อยู่ในระดับที่ไม่แน่นอน เนื่องจากบางครั้งสิ่งนี้อาจอธิบายพลวัตที่ไม่ชัดเจนของตัวบ่งชี้ทางคลินิกได้

สำหรับการเตรียมสารต่างๆ จะมีการกำหนดความเข้มข้นที่แน่นอนซึ่งจะสังเกตเห็นการแพร่พันธุ์ของประชากรไมโคแบคทีเรียในสัดส่วนวิกฤต ความเข้มข้นเหล่านี้เรียกว่า "วิกฤต" ขนาดของการเติบโตของประชากรไมโคแบคทีเรียในสารอาหารที่มีการเตรียมสารในความเข้มข้นวิกฤตจะถูกใช้เป็นเกณฑ์สำหรับความเสถียร

ในการปฏิบัติงานด้านพยาธิวิทยาที่บ้าน เมื่อพิจารณาการดื้อยา ไม่จำกัดอยู่แค่การพิจารณาความเข้มข้นวิกฤตเท่านั้น เนื่องจากคำจำกัดความที่ขยายออกไปของระดับการดื้อยาของเชื้อก่อโรคทำให้แพทย์สามารถกำหนดกลวิธีเคมีบำบัดได้อย่างถูกต้องมากขึ้น โดยใช้ความรู้เกี่ยวกับผลเสริมฤทธิ์ของการใช้ยาหลายตัวร่วมกัน เพื่อคาดการณ์การดื้อยาข้ามกลุ่ม หรือใช้ยาที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นจากกลุ่มยาต้านวัณโรคที่ใช้

วิธีการความเข้มข้นสัมบูรณ์เป็นวิธีที่ง่ายที่สุดแต่ยังอ่อนไหวต่อข้อผิดพลาดที่เกิดขึ้นในการนำไปใช้มากที่สุดอีกด้วย วิธีการตามสัดส่วนมีความน่าเชื่อถือมากกว่า โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อต้องพิจารณาความไวต่อยากลุ่มที่สองและแพร่หลายนอกรัสเซีย วิธีการนี้คำนึงถึงข้อบกพร่องของวิธีการความเข้มข้นสัมบูรณ์ แต่ต้องใช้แรงงานมากกว่าในการนำไปใช้

วิธีการนี้คล้ายคลึงกับวิธีการทำให้เข้มข้นโดยสมบูรณ์มาก การเตรียมหลอดทดลองด้วยยาจะเหมือนกับวิธีการทำให้เข้มข้นโดยสมบูรณ์ อย่างไรก็ตาม ปริมาณเมล็ดพันธุ์ของสารแขวนลอยของเชื้อวัณโรคไมโคแบคทีเรียมจะลดลง 10 เท่า ซึ่งจะขจัดความถี่ของการดื้อยาโดยธรรมชาติของเชื้อวัณโรคไมโคแบคทีเรียมบางชนิดต่อยา เช่น เอทัมบูทอล โพรไทโอนาไมด์ คาเพโรไมซิน สำหรับการควบคุม จะใช้หลอดทดลอง 2 หรือ 3 หลอดที่มีปริมาณเมล็ดพันธุ์เท่ากับปริมาณในหลอดทดลอง โดยเจือจาง 10 และ 100 เท่าตามลำดับ เกณฑ์สำหรับการดื้อยาคือสัดส่วนของการเติบโตของเชื้อวัณโรคไมโคแบคทีเรียมที่สังเกตได้ด้วยสายตา สำหรับยากลุ่มที่ 1 เกณฑ์สำหรับการดื้อยาคือการเติบโตเกิน 1% ของประชากรเริ่มต้น สำหรับยากลุ่มที่ 2 คือการเติบโต 1% หรือมากกว่า 10% ของประชากรเริ่มต้น ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นวิกฤตที่เลือก

ในปี พ.ศ. 2540 องค์การอนามัยโลกและกลุ่มงานสหภาพต่อต้านวัณโรคนานาชาติเกี่ยวกับการตรวจจับการดื้อยาต้านวัณโรคได้ปรับเกณฑ์เหล่านี้ โดยเสนอให้พิจารณาไมโคแบคทีเรียที่เจริญเติบโตในอาหารไข่ Lowenstein-Jensen ที่มีความหนาแน่นในความเข้มข้นต่อไปนี้ว่าดื้อยา:

• ไดฮโดรสเตรปโตมัยซิน - 4 μg/มล.
• ไอโซไนอาซิด - 0.2 µg/ml:
• ริแฟมพิซิน - 40 มก./มล.:
• เอทัมบูทอล - 2 มคก./มล.

ในปี พ.ศ. 2544 ได้มีการเสนอความเข้มข้นที่สำคัญสำหรับยาในกลุ่มที่สองดังต่อไปนี้ (สำหรับสัดส่วนที่สำคัญ 1%):

• คาเพโรไมซิน - 40 ไมโครกรัม/มล.
• โพรติโอนาไมด์ - 40 mcg/ml;
• คานามัยซิน - 30 μg/มล.
• ไวโอไมซิน - 30 μg/มล.
• ไซโคลซีรีน - 40 ไมโครกรัม/มล.
• กรดอะมิโนซาลิไซลิก - 0.5 mcg/ml;
• ออฟลอกซาซิน - 2 มก./มล.

ผลการเจริญเติบโตจะได้รับการประเมินหลังจาก 4 สัปดาห์เป็นเบื้องต้น และหลังจากการเพาะปลูก 6 สัปดาห์เป็นขั้นสุดท้าย

สำหรับการกำหนดความไวต่อยาต่อไพราซินาไมด์ ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในเคมีบำบัดวัณโรคสมัยใหม่ ความเข้มข้นวิกฤตที่แนะนำคือ 200 μg/ml อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีวิธีการที่ได้รับการยอมรับโดยทั่วไปสำหรับการกำหนดความต้านทานต่อยานี้ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เป็นของแข็ง เนื่องจากฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียของยานี้ปรากฏให้เห็นเฉพาะในสภาพแวดล้อมที่เป็นกรด (pH <6) ซึ่งในทางเทคนิคแล้วยากที่จะรักษาไว้ นอกจากนี้ เชื้อ Mycobacterium tuberculosis ในคลินิกจำนวนมากยังไม่สามารถเจริญเติบโตในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีสภาพแวดล้อมเป็นกรดได้

เพื่อประเมินคุณภาพของผลลัพธ์ของการกำหนดความไวต่อยาของเชื้อไมโคแบคทีเรีย ขอแนะนำให้ควบคุมอาหารเลี้ยงเชื้อ Lowenstein-Jensen แต่ละล็อตใหม่ด้วยการกำหนดความไวต่อเชื้อมาตรฐานสายพันธุ์ H37Rv ควบคู่กัน นอกจากนี้ ยังมีเกณฑ์ทางจุลชีววิทยาบางประการที่ต้องปฏิบัติตามเพื่อให้วิธีการต่างๆ ให้ผลลัพธ์ที่ทำซ้ำได้ดีและตีความได้อย่างถูกต้อง ซึ่งรวมถึงความสามารถในการดำรงอยู่ของเชื้อวัณโรค กฎเกณฑ์สำหรับการได้รับสารแขวนลอยและสารแขวนลอยที่เป็นเนื้อเดียวกัน กฎเกณฑ์สำหรับการคัดเลือกเชื้อวัณโรค และความเป็นตัวแทนของมวลแบคทีเรียที่เลือก ความน่าเชื่อถือของการกำหนดความต้านทานต่อยาจะลดลงเมื่อการขับถ่ายแบคทีเรียไม่ดีอย่างยิ่ง

เมื่อไม่นานมานี้ วิธีการตรวจสอบความไวต่อยาโดยใช้ระบบอัตโนมัติได้รับการยอมรับว่ามีแนวโน้มดี วิธีการที่มีความก้าวหน้ามากที่สุดในด้านนี้คือการพัฒนาบนพื้นฐานของ VASTEC MGIT-960 ในกรณีนี้ ความไวต่อยาของเชื้อวัณโรคจะถูกกำหนดโดยใช้วิธีสัดส่วนที่ปรับเปลี่ยน ในระหว่างการกำหนด อัตราการเติบโตของเชื้อวัณโรคในหลอดควบคุมและในหลอดที่บรรจุยาจะถูกเปรียบเทียบกัน เพื่อตรวจสอบความไวต่อสเตรปโตมัยซิน ไอโซไนอาซิด ริแฟมพิซิน และเอทัมบูทอล จะใช้สารเติมแต่งและยาปฏิชีวนะที่รวมอยู่ในชุด SIRE เพื่อตรวจสอบความไวต่อไพราซินาไมด์ จะใช้ชุด PZA ในระหว่างการทดสอบ หลอดทดลองที่บรรจุยาจะถูกฉีดเชื้อวัณโรคแขวนลอย รวมถึงหลอดควบคุมที่มีการเจือจางเชื้อวัณโรค 100 เท่าสำหรับยาทั้งหมด ยกเว้นไพราซินาไมด์ ซึ่งการเจือจางเชื้อวัณโรคจะอยู่ที่ 10 เท่า เกณฑ์สำหรับความเสถียรคือตัวบ่งชี้การเติบโตของไมโคแบคทีเรียที่ 100 GU เมื่อการเติบโตในหลอดควบคุมถึง 400 GU (ดู "วิธีการเพาะเลี้ยงเพื่อแยกไมโคแบคทีเรีย") ผลลัพธ์จะถูกบันทึกและตีความโดยอัตโนมัติและตั้งค่าโดยโปรแกรมที่ป้อนหรือเลือก

ความเข้มข้นสุดท้ายในหลอดทดลองที่มีสารอาหารเหลวใช้เป็นความเข้มข้นวิกฤต ปัจจุบันมีการพัฒนาความเข้มข้นวิกฤตสำหรับยาทั้งในกลุ่มแรกและกลุ่มที่สอง ควรสังเกตว่าการกำหนดความไวของเชื้อวัณโรคไมโคแบคทีเรียมต่อไซโคลเซอรีนและกรดอะมิโนซาลิไซลิกจะดำเนินการกับสารอาหารในไข่เท่านั้น

โปรโตคอลโดยละเอียดสำหรับการทำงานกับระบบที่อธิบายไว้ช่วยให้สามารถทดสอบความไวต่อยาได้ทั้งในวัฒนธรรมแยก (ที่มีสารอาหารหนาแน่น) และใช้การเจริญเติบโตขั้นต้นของไมโคแบคทีเรียในหลอดทดลอง MGIT ตัวเลือกหลังช่วยลดเวลาที่จำเป็นในการดำเนินการศึกษาวัฒนธรรมได้อย่างมาก ทำให้สามารถได้ผลลัพธ์เต็มรูปแบบในการเพาะเลี้ยงไมโคแบคทีเรียวัณโรค (รวมถึงข้อมูลเกี่ยวกับความไวต่อยา) ภายใน 3 สัปดาห์หลังจากรวบรวมวัสดุ ในขณะที่วิธีดั้งเดิมสามารถทำได้ภายในเดือนที่ 3 เท่านั้น ผลลัพธ์ที่ทันเวลาเมื่อผู้ป่วยอยู่ในระยะการรักษาที่เข้มข้นสามารถชดเชยค่าใช้จ่ายที่ค่อนข้างสูงของการศึกษาได้

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

การแยกความแตกต่างของไมโคแบคทีเรีย

เมื่อพิจารณาว่าสารอาหารที่ใช้ไม่ได้เลือกสรรอย่างเคร่งครัด การแยกเชื้อไมโคแบคทีเรียที่แยกได้ในภายหลังจึงถือเป็นสิ่งที่จำเป็น ความจำเป็นในการแยกเชื้อไมโคแบคทีเรียเกิดจากลักษณะเฉพาะหลายประการของกระบวนการทางพยาธิวิทยาที่เกิดจากตัวแทนของสกุลนี้ ได้แก่ การดำเนินโรคและผลลัพธ์ที่แตกต่างกันของวัณโรคและโรคไมโคแบคทีเรีย การมีอยู่ของการดื้อยาตามธรรมชาติต่อยาต้านวัณโรคบางชนิด

เป็นที่ยอมรับว่าการระบุเบื้องต้นของไมโคแบคทีเรียในกลุ่ม M. tuberculosis จากไมโคแบคทีเรียที่ไม่ใช่ TB ดำเนินการโดยอาศัยลักษณะดังต่อไปนี้: อัตราการเจริญเติบโตบนสื่อสารอาหารหนาแน่น การสร้างเม็ดสี สัณฐานวิทยาของโคโลนี การมีอยู่ของความต้านทานต่อกรด และอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการเจริญเติบโต

น่าเสียดายที่ไม่มีวิธีการในห้องปฏิบัติการวิธีเดียวที่จะสามารถแยกแยะไมโคแบคทีเรียในกลุ่ม M. tuberculosis จากไมโคแบคทีเรียที่ทนกรดชนิดอื่นได้อย่างน่าเชื่อถือ อย่างไรก็ตาม การรวมกันของสัญญาณที่อธิบายข้างต้นกับผลการทดสอบทางชีวเคมีจำนวนหนึ่งที่ระบุไว้ด้านล่าง ทำให้สามารถระบุไมโคแบคทีเรียในกลุ่ม M. tuberculosis ได้ด้วยความน่าจะเป็นสูงถึง 95%

การแยกความแตกต่างระหว่างไมโคแบคทีเรียในกลุ่ม M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii และอื่นๆ) จากไมโคแบคทีเรียที่ไม่ใช่เชื้อวัณโรคที่เจริญเติบโตช้า จะใช้การทดสอบทางชีวเคมีพื้นฐานเพื่อตรวจหาการมีอยู่ของสัญญาณต่อไปนี้:

• ความสามารถในการผลิตกรดนิโคตินิก (การทดสอบไนอาซิน):
• กิจกรรมไนเตรตรีดักเตส
• คาตาเลสที่ทนความร้อน
• การเจริญเติบโตบนอาหารที่มีโซเดียมซาลิไซเลต (1 มก./มล.)

เพื่อเป็นการทดสอบเพิ่มเติม สามารถใช้การทดสอบการเจริญเติบโตบนอาหารที่มีกรดพาราไนโตรเบนโซอิก 500 μg/ml หรือโซเดียมคลอไรด์ 5% ได้เช่นกัน

ห้องปฏิบัติการแบคทีเรียวิทยาจำนวนมากระบุจุลินทรีย์เหล่านี้ได้ในระดับที่ซับซ้อนเท่านั้น ซึ่งเป็นเพราะศักยภาพที่จำกัดของห้องปฏิบัติการและความสามารถเชิงวิธีการของผู้เชี่ยวชาญ

ในกรณีส่วนใหญ่ในทางปฏิบัติ การทดสอบต่อไปนี้เพียงพอที่จะแยกแยะ M. tuberculosis และ M. bovis ได้: ไนอาซิน ไนเตรตรีดักเตส ไพราซินาไมเดส และการลงทะเบียนการเจริญเติบโตบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีไฮดราไซด์กรดไทโอฟีน-2-คาร์บอกซิลิก 2 μg/ml โปรดทราบว่าไมโคแบคทีเรียในกลุ่ม M. tuberculosis มีลักษณะเฉพาะดังต่อไปนี้:

• การเจริญเติบโตช้า (มากกว่า 3 สัปดาห์)
• อุณหภูมิการเจริญเติบโตอยู่ระหว่าง 35-37 ^องศาเซลเซียส
• ไม่มีสี (สีงาช้าง)
• สีที่เด่นชัดและทนกรด
• ผลการทดสอบไนอะซินเป็นบวก
• ผลการทดสอบไนเตรตรีดักเตสเป็นบวก
• การขาดเอนไซม์คาตาเลสที่ทนความร้อนได้ (68 ^องศาเซลเซียส)
• การขาดการเจริญเติบโตในอาหาร Lowenstein-Jensen ที่ประกอบด้วย:
  • กรดซาลิไซลิกโซเดียม 1000 µg/ml
  • กรดพาราไนโตรเบนโซอิก 500 มก./มล.
  • โซเดียมคลอไรด์ 5%:
• การเจริญเติบโตในสภาพที่มีกรดไทโอฟีน-2-คาร์บอกซิลิก 1-5 μg/ml

ความเกี่ยวข้องของการแยกความแตกต่างของเชื้อไมโคแบคทีเรียที่แยกได้จะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญตามการเติบโตของความถี่ในการลงทะเบียนผู้ป่วย HIV/AIDS ที่เกี่ยวข้องกับวัณโรคหรือเชื้อไมโคแบคทีเรีย ในปัจจุบันยังไม่มีความแน่นอนโดยแน่นอนว่าห้องปฏิบัติการในภูมิภาคต่างๆ พร้อมที่จะทำงานปริมาณนี้ได้อย่างถูกต้องหรือไม่

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

การวินิจฉัยโรคภูมิคุ้มกันวัณโรค

มีปรากฏการณ์สากล การเตรียมการ และการทดสอบภูมิคุ้มกันจำนวนหนึ่งที่ค้นพบครั้งแรกโดยเฉพาะในวัณโรคหรือในรูปแบบของการตอบสนองภูมิคุ้มกันต่อไมโคแบคทีเรีย ซึ่งรวมถึง BCG และทูเบอร์คูลิน ปรากฏการณ์เช่น DST บนผิวหนัง (การทดสอบทูเบอร์คูลิน - ปฏิกิริยาของ Pirquet และ Mantoux) ปฏิกิริยาต่อการให้ทูเบอร์คูลินใต้ผิวหนังแก่สัตว์ที่ไวต่อเชื้อ (ปรากฏการณ์ Koch) แอนติบอดีแรกๆ ในโรคติดเชื้อยังถูกค้นพบในวัณโรคด้วย แน่นอนว่ายิ่งเข้าใจกลไกของภูมิคุ้มกันต่อวัณโรคและการควบคุมทางพันธุกรรมได้ลึกซึ้งมากเท่าไร การใช้วิธีการทางภูมิคุ้มกันและการเตรียมการที่ส่งผลต่อภูมิคุ้มกันในการแก้ปัญหาทางปฏิบัติของวัณโรคก็จะยิ่งกว้างขวางขึ้นเท่านั้น

ปัญหาในทางปฏิบัติที่สำคัญและซับซ้อนที่สุดในปัจจุบันคือการตรวจหาโรควัณโรคในกระบวนการคัดกรองประชากรจำนวนมาก อย่างไรก็ตาม แม้จะมีรายงานมากมายเกี่ยวกับ "ความสำเร็จ" (จากวัสดุที่มีจำกัด) แต่ก็ไม่มีวิธีการทางภูมิคุ้มกัน (ที่สามารถทำซ้ำได้ "ด้วยมือใดก็ได้") หรือยาที่เหมาะสมสำหรับจุดประสงค์ดังกล่าว

วิธีการทางภูมิคุ้มกัน โดยเฉพาะการศึกษาทางเซรุ่มวิทยา (การตรวจหาแอนติเจน แอนติบอดี) และการทดสอบกระตุ้นทูเบอร์คูลิน ถูกใช้กันอย่างแพร่หลายในทางคลินิก

วิธีการทางเซรุ่มวิทยาซึ่งตรวจหาแอนติเจนและแอนติบอดีในสภาพแวดล้อมต่างๆ ของร่างกาย ถือเป็นวิธีแรกในการศึกษาด้านภูมิคุ้มกันที่ใช้ในการวินิจฉัยแยกโรค

ความจำเพาะของการกำหนดแอนติบอดีต่อเชื้อวัณโรคขึ้นอยู่กับแอนติเจนที่ใช้ในการวิเคราะห์ภูมิคุ้มกัน แอนติเจนจำนวนมากได้รับการเสนอขึ้น โดยแอนติเจนตัวแรกคือทูเบอร์คูลิน พีพีดี:

• PPD และการเตรียมการที่ซับซ้อนอื่น ๆ จากของเหลววัฒนธรรม
• สารสลายตัวด้วยคลื่นอัลตราโซนิก
• สารสกัดไตรตอนและการเตรียมผนังเซลล์ที่ซับซ้อนอื่น ๆ
• 5-แอนติเจน (แดเนียล);
• แอนติเจน 60 (ค็อกซิโต)
• ลิโปอาราบิโนแมนแนน;
• ปัจจัยสาย (เทรฮาโลส-6,6-ได-ไมโคเลต)
• ฟีนอลิกและไกลโคลิปิดอื่นๆ
• ลิโปโพลีแซ็กคาไรด์
• แอนติเจนที่จับกับไฟโบนิคติน
• โปรตีน (ส่วนมากจะเป็นแบบรีคอมบิแนนท์); 81,65,38,34,30,19,18,16,15.12 KDA เป็นต้น

จากผลการวิจัยหลายปีของนักวิทยาศาสตร์ชาวรัสเซียและชาวต่างชาติ ทำให้สามารถระบุรูปแบบหลักของการสร้างแอนติบอดีและประสิทธิผลของการวินิจฉัยทางซีรัมวิทยาของวัณโรคได้ แอนติเจนยิ่งซับซ้อน ความไวก็จะยิ่งสูงขึ้นและความจำเพาะของการทดสอบก็จะยิ่งลดลง ความจำเพาะจะแตกต่างกันไปในแต่ละประเทศ ขึ้นอยู่กับการติดเชื้อของประชากรด้วยเชื้อวัณโรคและไมโคแบคทีเรียที่ไม่ใช่เชื้อวัณโรค การฉีดวัคซีน BCG เป็นต้น ในเด็ก การวินิจฉัยทางซีรัมมีข้อมูลน้อยกว่าในผู้ใหญ่ ในวัณโรคขั้นต้น (มักเป็นในเด็ก) การระบุ IgM จะให้ข้อมูลมากกว่า ในวัณโรคขั้นที่สอง - IgG ในผู้ติดเชื้อเอชไอวี การวินิจฉัยทางซีรัมมีข้อมูลน้อยลง ประสิทธิภาพของการตรวจหาแอนติบอดีขึ้นอยู่กับ "ช่วงเวลาทางคลินิก" หลายช่วง ได้แก่ กิจกรรมของกระบวนการ (การมีอยู่หรือไม่อยู่ของ "การแยก" ของไมโคแบคทีเรีย การมีอยู่ของโพรงผุ ระดับของการแทรกซึม) อุบัติการณ์ของกระบวนการ ระยะเวลาของการดำเนินการ

ความไวของวิธีเอนไซม์อิมมูโนแอสเซย์ (EIA) อยู่ที่ประมาณ 70% ประสิทธิภาพของการศึกษาไม่เพียงพอเนื่องจากความจำเพาะต่ำ ก่อนหน้านี้ ได้มีการพิจารณาความเป็นไปได้ในการใช้การคัดกรองทางซีรัมวิทยาในกลุ่มที่มีความเสี่ยงสูง โดยเฉพาะในผู้ที่มีการเปลี่ยนแปลงของปอดหลังเป็นวัณโรค

เพื่อเพิ่มความจำเพาะของ ELISA จึงมีการแสวงหาแอนติเจนที่จำเพาะมากขึ้น รวมถึงแอนติเจนที่ได้จากการตัดแต่งพันธุกรรม เช่น ESAT-6 เป็นต้น (ดูด้านบน) การใช้แอนติเจนที่จำเพาะอย่างเคร่งครัด (38 kDa, ESAT) ช่วยเพิ่มความจำเพาะ แต่ลดความไวของการวิเคราะห์ลงอย่างมาก นอกจาก ELISA (ระบบทดสอบในห้องปฏิบัติการทดลอง เช่น ชุด ELISA ของ Pathozyme) แล้ว ยังมีชุดอิมมูโนโครมาโตกราฟีที่มีการกรองด้านข้าง (Mycodot) รวมถึงการทดสอบอื่นๆ ที่คล้ายคลึงกัน (การวิเคราะห์จุดเมมเบรน) โดยการประเมินผลการทดสอบด้วยภาพ เมื่อทำการทดสอบเหล่านี้ การวิเคราะห์จะใช้เวลา 10-30 นาที ไม่ต้องใช้อุปกรณ์พิเศษ แต่ต้องใช้การประเมินผลลัพธ์ด้วยภาพ ซึ่งเกี่ยวข้องกับความคิดเห็นส่วนตัวในระดับหนึ่ง วิธีการเหล่านี้มีความไวและความจำเพาะที่ใกล้เคียงกัน (70% และ 90-93% ตามลำดับ) กับ ELISA แบบดั้งเดิม

การใช้การวิเคราะห์ภูมิคุ้มกันนั้นถือเป็นวิธีเสริมที่นำมาพิจารณาในการวินิจฉัยแยกโรควัณโรคโดยเฉพาะการวินิจฉัยโรควัณโรคชนิดนอกปอด วิธี ELISA มีประสิทธิภาพสูงสุดในการวินิจฉัยโรคเยื่อหุ้มสมองอักเสบจากเชื้อวัณโรคเมื่อตรวจน้ำไขสันหลัง ในกรณีนี้ ความไวของการวิเคราะห์อยู่ที่ 80-85% และความจำเพาะอยู่ที่ 97-98% มีข้อมูลเกี่ยวกับประสิทธิผลของการกำหนดแอนติบอดีต่อเชื้อวัณโรคในของเหลวในน้ำตาในการวินิจฉัยโรคยูเวอไอติสจากเชื้อวัณโรค

การเหนี่ยวนำการสังเคราะห์แกมมาอินเตอร์เฟอรอนในหลอดทดลอง

แกมมาอินเตอร์เฟอรอน (IFN-γ) เป็นปัจจัยในการป้องกันภูมิคุ้มกันเฉพาะ ซึ่งทำได้โดยการกระตุ้นระบบเอนไซม์ของแมคโครฟาจ การเหนี่ยวนำการสังเคราะห์ IFN-γ โดยทีลิมโฟไซต์ที่ไวต่อความรู้สึกเกิดจากการโต้ตอบกับแอนติเจนไมโคแบคทีเรีย

ทั้ง PPD ของทูเบอร์คูลินและแอนติเจนเฉพาะที่ได้จากการตัดแต่งพันธุกรรมนั้นใช้เป็นแอนติเจน โดยเฉพาะอย่างยิ่งแอนติเจน ESAT-6 (แอนติเจนที่หลั่งออกมาในระยะแรกที่มีมวลโมเลกุล 6 kDa) และ CFP-10 (โปรตีนกรองวัฒนธรรม 10 kDa) แอนติเจนที่ดัดแปลงพันธุกรรมหรือรีคอมบิแนนท์ไม่มีอยู่ในเซลล์ของวัคซีน BCG และไมโคแบคทีเรียชนิดอื่น เมื่อใช้ทูเบอร์คูลิน ผลการทดสอบการเหนี่ยวนำ IFN-γ จะเทียบได้กับผลการทดสอบทูเบอร์คูลินทางผิวหนัง (ความสัมพันธ์โดยตรง) เมื่อใช้แอนติเจนที่ดัดแปลงพันธุกรรม ผลการทดสอบจะมีความเฉพาะเจาะจงมากขึ้นและไม่ขึ้นอยู่กับการฉีดวัคซีน BCG ก่อนหน้านี้ เมื่อตรวจบุคคลที่ได้รับวัคซีนแล้วซึ่งไม่เคยสัมผัสกับการติดเชื้อวัณโรค ความจำเพาะของการทดสอบคือ 99% ความไวของการทดสอบในผู้ป่วยวัณโรคมีตั้งแต่ 81 ถึง 89%

การทดสอบและการวินิจฉัยได้รับการพัฒนาขึ้นโดยอาศัยการเพาะเลี้ยงเซลล์เม็ดเลือดทั้งหมดหรือเซลล์โมโนนิวเคลียร์ที่แยกจากเลือดที่มีแอนติเจนวัณโรคในหลอดทดลองในระยะสั้น ตามด้วยการกำหนดความเข้มข้นของ IFN-γ หรือการนับจำนวนเซลล์ทีลิมโฟไซต์ที่สังเคราะห์ IFN-γ ความเข้มข้นของอินเตอร์เฟอรอนที่สังเคราะห์ในหลอดทดลองจะถูกกำหนดโดย ELISA โดยใช้แอนติบอดีโมโนโคลนัลที่จับกับ IFN-γ จากนั้นใช้การปรับเทียบ IFN-γ มาตรฐานเพื่อกำหนดความเข้มข้นในหลอดทดลองหรือหลุมของแผ่น

ในการทดสอบ Elispot จะมีการนับจำนวนเซลล์ T ที่สังเคราะห์ IFN-γ บนพื้นผิวของจานเคลือบด้วยแอนติบอดีต่อ IFN-γ

ผู้พัฒนาวิธีทดสอบการเหนี่ยวนำ IFN-γ ในหลอดทดลอง ซึ่งได้รับการรับรองจากสำนักงานคณะกรรมการอาหารและยาของสหรัฐอเมริกา อ้างว่าการทดสอบนี้ไม่สามารถแยกความแตกต่างระหว่างการติดเชื้อวัณโรคแฝงกับวัณโรคระยะรุนแรงได้ ดังนั้น ในภูมิภาคที่มีอัตราการติดเชื้อสูง การทดสอบนี้จึงไม่มีค่าในการวินิจฉัยโดยตรง อย่างไรก็ตาม ในประเทศของเรา สามารถใช้แยกความแตกต่างระหว่างการติดเชื้อวัณโรคในเด็กกับอาการแพ้หลังการฉีดวัคซีนได้ รวมถึงใช้ประเมินระดับภูมิคุ้มกันเฉพาะในระหว่างการรักษา

ขณะนี้ระบบทดสอบในประเทศสำหรับการระบุการเหนี่ยวนำการสังเคราะห์ IFN-γ โดยแอนติเจนวัณโรคเฉพาะในหลอดทดลองกำลังอยู่ระหว่างการศึกษาวิจัย

สถานะภูมิคุ้มกันและการดำเนินโรคของวัณโรค การแก้ไขภูมิคุ้มกัน

ในระหว่างการรักษาโรค TB จะเกิดการเปลี่ยนแปลงของแอนติเจนและสถานะของระบบภูมิคุ้มกันในคน

ข้อมูลเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงของของเหลวและเนื้อเยื่อส่วนใหญ่มักขัดแย้งกัน สิ่งเดียวที่สามารถสังเกตได้อย่างชัดเจนคือ เนื้อเยื่อที่มีเนื้อเยื่ออักเสบจากวัณโรคโดยทั่วไปจะมีเซลล์ทีลิมโฟไซต์ที่ถูกกระตุ้นอยู่จำนวนมาก

เป็นเรื่องสมเหตุสมผลที่จะพูดถึงประเด็นเพิ่มเติมอีกสองประเด็นซึ่งจำเป็นต่อการทำความเข้าใจบทบาทของกลไกภูมิคุ้มกันในการรักษาโรค TB ในมนุษย์:

• ผู้ป่วยโรคเอดส์มีอุบัติการณ์การเกิดโรคดื้อยาหลายชนิดสูงมาก
• ในกรณีที่มีการดื้อยามากกว่าหนึ่งชนิด (และไม่มีการติดเชื้อ HIV) ความผิดปกติของภูมิคุ้มกัน (โดยเฉพาะภูมิคุ้มกันแบบเซลล์ที) จะมีความสำคัญเป็นพิเศษ

ในการรักษาผู้ป่วยวัณโรค มีการใช้การแก้ไขภูมิคุ้มกันหลายวิธีอย่างแพร่หลาย โดยวิธีแรกคือยาที่ออกฤทธิ์หลักกับภูมิคุ้มกันของเซลล์ทีและระบบฟาโกไซต์โมโนนิวเคลียร์ (ฮอร์โมนไทมัส ไอโซโฟน ลิโคปิด โพลิออกซิโดเนียม เป็นต้น) เช่นเดียวกับไมโคแบคทีเรียชนิดสมบูรณ์ (ที่ถูกทำให้ลดความรุนแรงลง) และส่วนประกอบของแบคทีเรียเหล่านั้น

การวินิจฉัยวัณโรคด้วยชีวโมเลกุล

วิธีการทางชีววิทยาโมเลกุลในการวินิจฉัยโรคติดเชื้อส่วนใหญ่ประกอบด้วยวิธีการที่อิงตามการจัดการวัสดุจีโนมของเชื้อก่อโรคแบคทีเรียและไวรัสเพื่อระบุวัสดุทางพันธุกรรมเฉพาะ - ส่วนดีเอ็นเอที่มีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เฉพาะเจาะจงกับสปีชีส์หรือสายพันธุ์ของเชื้อก่อโรคที่กำหนด สำหรับการวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอเฉพาะในยีนที่กำหนดความไวของเชื้อก่อโรคต่อยาบางชนิด รวมถึงสำหรับการวิเคราะห์กิจกรรมการทำงานของยีนบางชนิดของเชื้อก่อโรค วิธีการทางชีววิทยาโมเลกุลได้แพร่หลายในงานวิจัยทางวิทยาศาสตร์และการประยุกต์ใช้ในทางปฏิบัติในการวินิจฉัยและติดตามการติดเชื้อแบคทีเรียและไวรัสต่างๆ หลังจากที่ Carrie Mullis (ผู้ได้รับรางวัลโนเบล 1989) ค้นพบปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสในปี 1985

หลักการและความสามารถของวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส

PCR ช่วยให้ขยาย (ทวีคูณ) ลำดับนิวคลีโอไทด์ (ชิ้นส่วนของ DNA ของเชื้อก่อโรค) ในหลอดทดลองได้ภายในเวลาไม่กี่ชั่วโมง โดยเพิ่มได้เป็นล้านเท่า การดำเนินการปฏิกิริยาในสถานะที่มี DNA สายเดี่ยวจะกำหนดความไวของการวิเคราะห์ที่สูงเป็นพิเศษ

ลำดับนิวคลีโอไทด์ของส่วนต่างๆ ของสาย DNA กำหนดความเป็นเอกลักษณ์ทางพันธุกรรมของจุลินทรีย์ ซึ่งอธิบายถึงความจำเพาะสูงของ PCR

ความสำคัญของวิธีนี้ในการตรวจหาและศึกษาลักษณะเฉพาะของเชื้อ Mycobacterium tuberculosis เนื่องมาจากลักษณะทางชีววิทยาของจุลินทรีย์ซึ่งมีการเจริญเติบโตช้ามาก โดยระยะเวลาในการเพิ่มจำนวน DNA ของเชื้อ Mycobacterium tuberculosis สองเท่าในระหว่างการเพาะเลี้ยงคือ 12-24 ชั่วโมง

หลักการของวิธี PCR คือ การขยายพันธุ์ - การเพิ่มจำนวนส่วนต่างๆ ของลำดับ DNA เฉพาะในไมโครโวลูมของหลอดทดลองหลายๆ ล้านครั้งด้วยการทำซ้ำแบบวนซ้ำของขั้นตอนปฏิกิริยาทั้งสามต่อไปนี้ โดยแต่ละขั้นตอนจะเกิดขึ้นในระบอบอุณหภูมิที่แตกต่างกัน:

• ระยะที่ 1 - การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของดีเอ็นเอสายคู่เมื่อได้รับความร้อนจนทำให้สายดีเอ็นเอแยกออกจากกัน
• ระยะที่ II – การจับกันแบบเสริม (ไฮบริดิเซชัน) ของไพรเมอร์ (ไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์) กับส่วนปลายของโซ่ของชิ้นส่วน DNA ที่เฉพาะเจาะจงอย่างเคร่งครัดที่เลือกสำหรับการขยาย
• ระยะที่ III – การสร้างโซ่ชิ้นส่วน DNA เสร็จสมบูรณ์โดยใช้ DNA โพลิเมอเรสที่ทนความร้อน

สำหรับการขยายหลอดทดลองจะต้องมีโมเลกุลของดีเอ็นเอเมทริกซ์ ดีออกซีนิวคลีโอไซด์ไตรฟอสเฟต (นิวคลีโอไทด์) สี่ประเภทที่มีเบสไนโตรเจนที่สอดคล้องกัน ได้แก่ อะดีนีน (A) ไทมีน (T) กัวนีน (G) ไซโทซีน (C) โอลิโกนิวคลีโอไทด์ไพรเมอร์สังเคราะห์เทียม (ไพรเมอร์) ประกอบด้วยเบสคู่ 18-20 เบส เอนไซม์ที่ทนความร้อน ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส ที่มีอุณหภูมิเหมาะสม 68-72 ^° C และไอออนแมกนีเซียม

ความจำเพาะของ PCR ขึ้นอยู่กับการเลือกชิ้นส่วน DNA จากนั้นจะสังเคราะห์ไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่อยู่ติดกัน ความจำเพาะของไฮบริดิเซชันและการเติมเต็มของห่วงโซ่ DNA จะถูกกำหนดโดยหลักการของความสมบูรณ์ของเบสไนโตรเจนคู่ต่อไปนี้: อะดีนีน-ไทมีน, กัวนีน-ไซโทซีน

ในการตรวจสอบจีโนมของเชื้อวัณโรค เป้าหมายการขยายพันธุ์ที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดในระบบทดสอบส่วนใหญ่คือชิ้นส่วน DNA IS6110 ซึ่งในสายพันธุ์เชื้อวัณโรคส่วนใหญ่มีจำนวนมาก (10-20) ของซ้ำในจีโนม ซึ่งช่วยให้แน่ใจได้ว่าการวิเคราะห์จะมีความไวสูง พร้อมกันนั้น ได้มีการอธิบายสายพันธุ์เชื้อวัณโรคที่มีจำนวนซ้ำเล็กน้อยหรือไม่มีชิ้นส่วน IS6110

การสกัดโมเลกุล DNA จากตัวอย่างทางชีววิทยา

ในการทำ PCR จะต้องแยกโมเลกุล DNA ของเชื้อก่อโรคออกจากสารชีวภาพด้วยปริมาตรที่น้อยที่สุด โดยมี DNA ที่ไม่จำเพาะและสารยับยั้งเอนไซม์ต่างๆ - DNA โพลิเมอเรสในปริมาณน้อยที่สุด

การเตรียมตัวอย่างจะต้องดำเนินการภายใต้เงื่อนไขที่ป้องกันการปนเปื้อนข้ามของตัวอย่างที่กำลังศึกษากับโมเลกุล DNA ที่แยกจากกัน ซึ่งต้องมีการบำบัดเบื้องต้นในห้องด้วยแสงอัลตราไวโอเลต พื้นและพื้นผิวการทำงานของโต๊ะและอุปกรณ์ด้วยสารละลายที่มีคลอรีน นอกจากนี้ ยังจำเป็นต้องใช้ถุงมือที่สะอาด หลอดทดลองแบบใช้แล้วทิ้ง และหัววัดสำหรับปิเปตอัตโนมัติ

ในการแยก DNA ของเชื้อ Mycobacterium tuberculosis จากตัวอย่างทางคลินิก (น้ำไขสันหลัง การล้างหลอดลม) ที่ไม่มีเม็ดเลือดขาว เศษเซลล์ หรือเกลือจำนวนมาก ก็เพียงแค่ปั่นตัวอย่างที่ความเร็ว 3,000-4,000 รอบต่อนาที เติม Triton X-100 ความเข้มข้น 2% จำนวน 20-30 µl ลงในตะกอน แล้วให้ความร้อนที่ 90 ^องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที

การเตรียมตัวอย่างเสมหะต้องทำให้เป็นของเหลวอย่างมีประสิทธิภาพ โดยทั่วไปจะใช้โซเดียมไฮดรอกไซด์ 4% และ N-acetyl-L-cysteine (NALC) ที่ 50-80 มก. ต่อตัวอย่าง ขึ้นอยู่กับความหนืดของตัวอย่าง ควรเตรียมสารละลาย NALC ทันที หรืออาจเติมผง NALC ลงในตัวอย่างโดยตรงโดยไม่ต้องแช่น้ำ หลังจากทำให้เป็นของเหลวแล้ว ควรปั่นตัวอย่างเป็นเวลา 15 นาทีที่ความเร็ว 3,500-4,000 รอบต่อนาที (3,000 กรัม) ในหลอดที่มีฝาเกลียวขนาด 50 มล. ภายใต้เงื่อนไขเดียวกันกับที่แนะนำสำหรับการเตรียมเสมหะก่อนเพาะเชื้อ

ในการสกัด DNA จากตะกอน จะใช้วิธีการที่ใช้สารละลายกัวนิดีนไอโซไทโอไซยาเนต 5-6 โมลาร์เป็นสารสลายตัวและอนุภาคซิลิกอนออกไซด์ที่มีรูพรุนขนาดเล็ก ("ดินเบา") ซึ่งมักจะใช้ดูดซับโมเลกุล DNA จากนั้นล้างสารที่ไม่จำเพาะ รวมถึงสารยับยั้งที่เป็นไปได้ด้วยสารละลายกัวนิดีนไอโซไทโอไซยาเนต 2.5 โมลาร์และสารละลายเอธานอล หลังจากนั้นจึงแยกโมเลกุล DNA ในน้ำ แล้วจึงใช้ตัวอย่างเหล่านี้เพื่อทำปฏิกิริยา PCR เพื่อลดความซับซ้อนของเทคโนโลยีการสกัด DNA มักจะใช้ "ดินเบา" แทนอนุภาคแม่เหล็กที่เคลือบด้วยซิลิกอนออกไซด์ ในกรณีนี้ จะใช้แท่นแม่เหล็กพิเศษสำหรับไมโครทิวบ์เพื่อตกตะกอนอนุภาคแทนการปั่นเหวี่ยง

วิธีดั้งเดิมของการแยกเชื้อไมโคแบคทีเรียด้วยภูมิคุ้มกันแม่เหล็กพร้อมการสกัดดีเอ็นเอของเชื้อก่อโรคในภายหลังได้รับการพัฒนาในรัสเซีย สำหรับการแยกเชื้อไมโคแบคทีเรียด้วยภูมิคุ้มกันแม่เหล็ก จะใช้เฟอร์โรพาร์ติเคิลขนาด 3-5 ไมโครเมตรเคลือบด้วยซิลิกอนออกไซด์ ซึ่งจะยึดแอนติบอดีโพลีโคลนอล (กระต่าย) ต่อเชื้อไมโคแบคทีเรียด้วยพันธะเคมี ตัวอย่างเสมหะหลังจากการสลายด้วยด่างจะถูกทำให้เป็นกลางด้วยสารละลาย Tris-HCl ที่เป็นกรด และฟักด้วยตัวดูดซับด้วยภูมิคุ้มกันแม่เหล็ก จากนั้นจึงเก็บเฟอร์โรพาร์ติเคิลด้วยภูมิคุ้มกันแม่เหล็กโดยใช้แท่งแม่เหล็กที่มีปลายที่เปลี่ยนได้ ถ่ายโอนไปยังไมโครทิวบ์ และตกตะกอน เติมสารละลาย Triton X-100 2% จำนวน 20-30 ไมโครลิตร แล้วให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 90 ^องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที ส่วนที่เป็นของเหลวจะถูกใช้เป็นเมทริกซ์ดีเอ็นเอสำหรับการวิเคราะห์ PCR

ปัญหาที่ยากคือการสกัด DNA ของแบคทีเรียมวัณโรคจากชิ้นเนื้อที่นำมาตรวจ สำหรับการสลายชิ้นเนื้อ จะใช้เอนไซม์โปรตีเนสเคในความเข้มข้นสุดท้าย 200-500 มก./ล. ที่อุณหภูมิ 56 ^องศาเซลเซียสค้างคืน จากนั้นสกัดโดยใช้หนึ่งในวิธีที่ทราบกันดีอยู่แล้ว DNA ที่ไม่จำเพาะเกินในการวิเคราะห์ PCR ของชิ้นเนื้อที่นำมาตรวจมักทำให้ปฏิกิริยาถูกยับยั้ง ซึ่งต้องสกัด DNA ซ้ำหลายครั้ง

วิธีการตรวจจับผลลัพธ์

หลังจากปฏิกิริยาเสร็จสมบูรณ์ ชิ้นส่วนที่ขยายของ DNA ของเชื้อก่อโรคจะถูกระบุโดยใช้หลากหลายวิธี

วิธีการอิเล็กโทรโฟรีซิสแบบเจลเป็นที่รู้จักกันดี ในกรณีนี้ ชิ้นส่วน DNA ที่ได้จะถูกระบุด้วยตัวควบคุมเชิงบวกที่มีชิ้นส่วน DNA ที่ต้องการโดยเฉพาะ หรือด้วยขนาดที่ทราบก่อนหน้านี้ (จำนวนคู่ของนิวคลีโอไทด์) ของชิ้นส่วน ซึ่งจะถูกกำหนดโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลมาตรฐาน

ในกรณีที่มีสีย้อมเฉพาะ - เอทิดิอัมโบรไมด์ ซึ่งรวมอยู่ใน DNA สายคู่ ชิ้นส่วน DNA ที่สังเคราะห์ขึ้นจะปรากฏเป็นแถบที่เรืองแสงภายใต้อิทธิพลของแสงอัลตราไวโอเลต

ขนาดของชิ้นส่วน DNA ที่กำหนดโดยอิเล็กโทรโฟเรซิสตามระยะทางที่เดินทางจากจุดเริ่มต้น จะต้องสอดคล้องกับเครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุลที่ทราบหรือตัวควบคุมเชิงบวก

วิธีการอื่นในการกำหนดผล PCR ขึ้นอยู่กับไฮบริดิเซชันของผลิตภัณฑ์ PCR สายเดี่ยวกับโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่เป็นส่วนเติมเต็ม - โพรบ DNA ที่ติดฉลากด้วยไบโอติน ตามด้วยการตรวจจับโดยใช้ปฏิกิริยาทางเอนไซม์โดยตัวอย่างเช่น การจับคอนจูเกตสเตรปตาติดิน-อัลคาไลน์ฟอสฟาเตสกับไบโอติน

เครื่องวิเคราะห์ PCR ถูกสร้างขึ้นโดยอาศัยการตรวจจับประเภทนี้ ซึ่งสามารถตรวจจับผล PCR โดยอัตโนมัติหลังจากอ่านความหนาแน่นแสงในตัวอย่างหลังจากปฏิกิริยาทางเอนไซม์เกิดขึ้น

ข้อเสียของวิธีการเหล่านี้ ได้แก่ ความเป็นไปได้ของการปนเปื้อนภายในห้องปฏิบัติการด้วยชิ้นส่วนโมเลกุล DNA ขนาดสั้น เมื่อโมเลกุลเหล่านี้เข้าสู่ตัวอย่างที่ทดสอบใหม่ พวกมันจะกลายเป็นเมทริกซ์สำหรับ PCR และทำให้ได้ผลบวกปลอม

ในเรื่องนี้ เพื่อป้องกันผลลัพธ์บวกปลอม จึงได้กำหนดกฎเกณฑ์ที่เข้มงวดสำหรับการแยกและแยกห้อง: ห้องสกัด DNA จากตัวอย่างทางชีววิทยา ห้องสำหรับตรวจจับผลลัพธ์ (อิเล็กโตรโฟเรซิส) จากโซนสะอาด ห้องเหล่านี้เป็นโซนที่อาจเกิดการปนเปื้อน โซนแยกอีกโซนหนึ่งคือห้องสะอาดสำหรับการนำตัวอย่าง DNA ที่กำลังศึกษามาใส่ในหลอดทดลองพร้อมกับส่วนผสมปฏิกิริยาสำหรับ PCR และสุดท้าย สันนิษฐานว่าควรนำอุปกรณ์หลัก - เครื่องขยาย DNA - ออกไปที่ห้องแยกต่างหาก ซึ่งอาจเป็นห้องสำนักงาน

เพื่อป้องกันการปนเปื้อนจากผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยาก่อนหน้า - แอมพลิคอน ระบบทดสอบ PCR บางระบบมีดีออกซีนิวคลีโอไซด์ยูริดีนแทนดีออกซีนิวคลีโอไซด์ไทมิดีน ซึ่งสร้างขึ้นในตำแหน่งที่สอดคล้องกันระหว่างการสังเคราะห์โซ่ในหลอดทดลอง กล่าวคือ ไทมีนเบสไนโตรเจนที่มีอยู่ในดีเอ็นเอดั้งเดิมจะถูกแทนที่ด้วยยูราซิล ไกลโคซิเลสดีเอ็นเอยูราซิลที่เติมลงในส่วนผสมปฏิกิริยาของวัสดุที่วิเคราะห์จะทำลายเฉพาะชิ้นส่วนที่ปนเปื้อนด้วยดีออกซียูริดีนเท่านั้น แต่ไม่ทำลายดีเอ็นเอดั้งเดิมที่วิเคราะห์ซึ่งมีดีออกซีไทมิดีน การให้ความร้อนในภายหลังที่ 94 ^องศาเซลเซียสจะทำให้เอนไซม์นี้ไม่ทำงานและไม่รบกวนการขยายใน PCR

มีระบบการทดสอบที่ใช้การขยาย rRNA แบบอุณหภูมิคงที่ โดยทำการถอดรหัสย้อนกลับและสังเคราะห์โมเลกุล DNA ก่อน ซึ่งจะกลายเป็นเมทริกซ์สำหรับการสังเคราะห์โมเลกุล RNA ในภายหลัง แอมพลิคอน RNA จะถูกตรวจพบโดยใช้โพรบ DNA ที่ย้อมด้วยอะคริดีนระหว่างการผสมข้ามพันธุ์ในสารละลายหลอดปฏิกิริยา วิธีนี้นอกจากจะมีความไวสูงแล้ว ยังมีข้อดีคือสามารถวิเคราะห์ได้ในหลอดเดียว ซึ่งช่วยป้องกันการปนเปื้อนได้ ตามที่ผู้เขียนกล่าวไว้ ความไวของวิธีนี้ในตัวอย่างทางเดินหายใจจะสูงถึง 90% โดยมีความจำเพาะ 99-100%

มีการนำวิธีการตรวจจับแบบใหม่มาใช้ใน PCR แบบเรียลไทม์ วิธีการเหล่านี้แตกต่างกันตรงที่ PCR และการตรวจจับผลลัพธ์จะดำเนินการพร้อมกันในหลอดทดลองปิดหลอดเดียว ซึ่งไม่เพียงแต่ช่วยลดความซับซ้อนของวิธีการวิเคราะห์เท่านั้น แต่ยังป้องกันการปนเปื้อนของสถานที่ในห้องปฏิบัติการและตัวอย่างจากผลิตภัณฑ์ของ PCR ก่อนหน้านี้ด้วย

ใน PCR แบบเรียลไทม์ ผลลัพธ์จะถูกตรวจจับโดยการเรืองแสงที่เกิดจากการผสมพันธุ์ระหว่างโพรบ DNA ที่เรืองแสงกับชิ้นส่วน DNA เฉพาะที่ขยายตัวในระหว่าง PCR โครงสร้างของโพรบ DNA ที่เรืองแสงถูกสร้างขึ้นในลักษณะที่มาร์กเกอร์เรืองแสงจะถูกปล่อยออกมาเป็นผลจากปฏิกิริยาของเอนไซม์หรือแยกตัวออกจากโมเลกุลดับเรืองแสงเฉพาะเมื่อมีการผสมพันธุ์เฉพาะกับโมเลกุล DNA ที่ต้องการที่ขยายตัวในระหว่าง PCR เมื่อจำนวนโมเลกุลที่ผสมพันธุ์กับโพรบเพิ่มขึ้น การเพิ่มขึ้นของการเรืองแสงจนถึงระดับที่ตรวจจับได้จะแปรผันตามจำนวนโมเลกุลของผลิตภัณฑ์ที่ขยาย เนื่องจากจำนวนโมเลกุลชิ้นส่วน DNA จะเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าในแต่ละรอบ PCR จำนวนรอบที่ตรวจพบการเรืองแสงและเพิ่มขึ้นจะแปรผกผันกับจำนวนโมเลกุล DNA ในตัวอย่างดั้งเดิม หากมีการนำโมเลกุลของชิ้นส่วนของ DNA ของแบคทีเรียมวัณโรคที่มีความเข้มข้นที่ทราบต่างกันหลายโมเลกุลเข้ามาทำปฏิกิริยาเพื่อปรับเทียบ ก็จะสามารถคำนวณจำนวนจีโนมของ DNA ในวัสดุที่กำลังศึกษาได้โดยใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์

ตัวอย่างมาตรฐานแต่ละตัวอย่างจะถูกทำซ้ำ เกณฑ์เชิงปริมาณคือจำนวนรอบ PCR ขั้นต่ำที่จำเป็นสำหรับการเริ่มต้นและการเติบโตของการเรืองแสงที่ตรวจจับได้ แกนแอ็บซิสซาคือจำนวนรอบ แกนออร์ดิเนตคือค่าการเรืองแสง ความเข้มข้นของ DNA จะแปรผกผันกับจำนวนรอบที่จำเป็นสำหรับการเรืองแสงที่จะปรากฏขึ้น หน้าต่างในคอลัมน์ด้านขวา (21-32) แสดงหมายเลขรอบสำหรับความเข้มข้นที่สอดคล้องกัน ความแตกต่างระหว่างความเข้มข้น 10 เท่าของชิ้นส่วน DNA ขนาด 10 ² -10 ⁶มล. คือ 3.2-3.4 รอบ สำหรับผู้ป่วย 2 ราย ความเข้มข้นของชิ้นส่วน IS6110 อยู่ที่ประมาณ 10 ³ /มล. และ 10 ⁴ /มล. เมื่อคำนึงถึงจำนวนการทำซ้ำ (6-20) ของชิ้นส่วนที่วิเคราะห์ในจีโนมของ Mycobacterium tuberculosis จำนวน Mycobacterium tuberculosis ในตัวอย่างทางคลินิกอยู่ที่ประมาณ 100 และ 1,000 เซลล์ตามลำดับ

การประยุกต์ใช้ PCR ในการวินิจฉัยโรควัณโรค

วิธี PCR ถูกใช้ในระดับสูงสุดเพื่อวินิจฉัยวัณโรคอย่างรวดเร็ว - ตรวจหาเชื้อ Mycobacterium tuberculosis ในตัวอย่างทางคลินิก ได้แก่ เสมหะ การล้างหลอดลม สารคัดหลั่งจากเยื่อหุ้มปอด ปัสสาวะ น้ำไขสันหลัง การเจาะเพื่อสลายกระดูก การดูดของอวัยวะสืบพันธุ์สตรี และชิ้นเนื้อต่างๆ ในการศึกษาตัวอย่างเสมหะและหลอดลมประมาณ 500 ตัวอย่างจากผู้ป่วย 340 รายที่ได้รับการยืนยันว่าเป็นโรควัณโรคปอดที่ประเทศเนเธอร์แลนด์ ได้มีการศึกษาความไวเปรียบเทียบระหว่างวิธี PCR การเพาะเชื้อ และการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบสเมียร์ ความไวของการวิเคราะห์คือ 92.6, 88.9 และ 52.4% ตามลำดับ ความจำเพาะของวิธีการทั้งหมดคือประมาณ 99%

มีการเปรียบเทียบประสิทธิภาพการตรวจหาเชื้อ Mycobacterium tuberculosis โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบสเมียร์ การหว่านเชื้อบนอาหาร Lowenstein-Jensen ระบบทดสอบ VASTES และการวิเคราะห์ PCR โดย PCR แสดงความไว 74.4% กล้องจุลทรรศน์ 33.8% การหว่านเชื้อบนอาหารแข็ง 48.9% และ VASTES 55.8% เวลาตรวจจับเฉลี่ยสำหรับการหว่านเชื้อบนอาหาร Lowenstein-Jensen คือ 24 วัน VASTES 13 วัน PCR 1 วัน

ยังมีการหารือถึงศักยภาพในการใช้ PCR เป็นวิธีการที่รวดเร็วและละเอียดอ่อนในการติดตามประสิทธิผลของการรักษาโรค TB อีกด้วย

การตรวจหา DNA ของเชื้อ Mycobacterium tuberculosis โดยวิธี PCR ร่วมกับเคมีบำบัดที่มีประสิทธิผลจะใช้เวลาในการตรวจหาที่ยาวนานกว่า คือ โดยเฉลี่ย 1.7 เดือนเมื่อเปรียบเทียบกับการขับถ่ายแบคทีเรียด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ และ 2.5 เดือนเมื่อเปรียบเทียบกับการตรวจทางแบคทีเรียวิทยา

การวินิจฉัยวัณโรคชนิดนอกปอด

ความสำคัญของ PCR ในฐานะวิธีที่มีความละเอียดอ่อนนั้นมีความสำคัญอย่างยิ่งโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับรูปแบบนอกปอด เนื่องจากรูปแบบเหล่านี้โดยเฉพาะทำให้วิธีการทางคลินิกและทางรังสีวิทยา รวมถึงวิธีทางแบคทีเรียวิทยาแบบดั้งเดิมในการตรวจเชื้อ Mycobacterium tuberculosis ในวัสดุการวินิจฉัยไม่ได้ผล

เมื่อตรวจตัวอย่างปัสสาวะ ผลการวิเคราะห์ PCR เป็นผลบวกในผู้ป่วย 16 รายจากทั้งหมด 17 รายที่เป็นวัณโรคของระบบทางเดินปัสสาวะ และเป็นลบในผู้ป่วยวัณโรคไตที่ไม่เป็นวัณโรค 4 ราย และผู้ป่วยโรคทางเดินปัสสาวะที่ไม่ใช่วัณโรค 39 ราย

ประสิทธิภาพของการวิเคราะห์ PCR ในการศึกษาการดูดไขกระดูกในผู้ป่วยที่มีไข้ไม่ทราบสาเหตุและสงสัยว่าเป็นโรควัณโรคได้รับการพิสูจน์แล้ว สำหรับการวินิจฉัยต่อมน้ำเหลืองอักเสบจากวัณโรคในเด็ก ได้มีการศึกษาการดูดไขกระดูก 102 ตัวอย่างและตัวอย่างชิ้นเนื้อจากเด็ก 67 คนที่สงสัยว่าเป็นวัณโรค ผลการตรวจเป็นบวก โดยวิธี real-time PCR ได้ผล 71.6%, กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ได้ผล 46.3%, การเพาะเชื้อได้ผล 41.8% ในการศึกษาชิ้นเนื้อต่อมน้ำเหลือง 50 ชิ้นในผู้ป่วยโรคแมวข่วน ผลการตรวจเป็นลบทั้งหมด ดังนั้น การวิเคราะห์ PCR จึงมีความจำเพาะ 100% ในงานเดียวกันนี้ แสดงให้เห็นถึงความเป็นไปได้ในการตรวจพบ M. avium ในการเจาะชิ้นเนื้อต่อมน้ำเหลือง

การวินิจฉัยวัณโรคอวัยวะเพศหญิงในภาวะมีบุตรยากถือเป็นปัญหาการวินิจฉัยที่ยากที่สุดอย่างหนึ่ง ผลการตรวจ PCR ของชิ้นเนื้อเยื่อบุโพรงมดลูก การดูดเยื่อบุโพรงมดลูก และตัวอย่างของเหลวในถุงดักลาสพบในผู้ป่วย 14 ราย (56%) จากทั้งหมด 25 รายที่ตรวจโดยการส่องกล้องและสงสัยว่าเป็นวัณโรค ผลการตรวจสเมียร์และเพาะเชื้อให้ผลบวก 1 และ 2 รายตามลำดับ โดยผู้ป่วยเหล่านี้ยังพบผล PCR บวกด้วย ผล PCR บวกส่วนใหญ่มักพบในผู้ป่วยที่มีลักษณะเฉพาะของวัณโรคตามการตรวจทางเนื้อเยื่อวิทยา ส่วนจำนวนผู้ป่วยที่สงสัยว่าเป็นวัณโรคตามการส่องกล้องมีจำนวนน้อยกว่า ผู้ป่วยที่สงสัยว่าเป็นวัณโรคตามการส่องกล้องพบผล PCR บวกเพียง 1 รายเท่านั้นในกรณีที่ไม่มีข้อมูลการส่องกล้องสำหรับวัณโรค

เมื่อทำการวินิจฉัยวัณโรคชนิดนอกปอด แพทย์มักมีคำถามเกี่ยวกับความเป็นไปได้ในการระบุเชื้อก่อโรคเมื่อตรวจตัวอย่างเลือดโดยใช้เทคนิค PCR ข้อมูลจากเอกสารระบุว่าการตรวจหา DNA ของเชื้อ Mycobacterium tuberculosis จากตัวอย่างเลือดสามารถทำได้ในการติดเชื้อ HIV ในระยะลุกลาม โดยสามารถตรวจพบ DNA ของเชื้อ Mycobacterium tuberculosis ในวัณโรคทั่วไปของอวัยวะต่างๆ ในผู้ป่วยที่ได้รับการปลูกถ่ายไตและมีภูมิคุ้มกันบกพร่องเท่านั้น

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

การระบุชนิดของเชื้อไมโคแบคทีเรีย

วิธี PCR ค่อนข้างมีประสิทธิภาพในการระบุเชื้อวัณโรคและเชื้อวัณโรคบางชนิดได้อย่างรวดเร็วหลังจากได้รับการเจริญครั้งแรก ในกรณีนี้ การใช้ PCR ช่วยประหยัดเวลา 7-10 วันที่จำเป็นสำหรับการระบุเชื้อวัณโรคในภายหลังเพื่อผลลัพธ์เชิงบวก การศึกษา PCR นั้นง่ายมากในทางเทคนิค เนื่องจากไม่จำเป็นต้องเตรียมตัวอย่างวัสดุทางคลินิกที่ซับซ้อนเพื่อให้ได้ความไวสูง เมื่อตรวจสอบเชื้อวัณโรคเชิงบวก 80 เชื้อในระบบทดสอบดังกล่าว (MB BacT. โดย Organon) ผลการวิเคราะห์ PCR เชิงบวกทั้งหมดจะมีความเฉพาะเจาะจงอย่างเคร่งครัดและดำเนินการภายใน 1 วัน เพื่อระบุเชื้อวัณโรคชนิดอื่นๆ เมื่อได้เชื้อวัณโรคในเชื้อวัณโรคนั้น ดีเอ็นเอของเชื้อก่อโรคจะถูกไฮบริดไดซ์กับโพรบดีเอ็นเอเฉพาะที่ติดฉลากด้วยอะคริดีน และสายพันธุ์จะถูกตรวจจับโดยการปรากฏตัวของเคมีเรืองแสงโดยใช้เคมีเรืองแสงหรือบนแถบไนโตรเซลลูโลสด้วยการประเมินด้วยสายตาหลังจากไฮบริดไดซ์ ชุดทดสอบนี้ระบุสายพันธุ์จำนวนจำกัด ได้แก่ Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii และ M. gordonae

A. Telenti และคณะได้พัฒนาวิธีที่ค่อนข้างง่ายและราคาไม่แพงสำหรับการระบุชนิดของไมโคแบคทีเรียที่มีความสำคัญทางคลินิกโดยใช้ PCR และการบำบัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ 2 ชนิด (เอนไซม์ที่มีความสามารถในการตัดโมเลกุล DNA ที่จุดเฉพาะ) ในกรณีนี้ ชิ้นส่วน DNA ที่เข้ารหัสโปรตีนจากความร้อน (65 kDa) จะถูกขยาย หลังจากนั้น ชิ้นส่วน DNA ที่ได้จาก PCR ซึ่งมีขนาด 439 คู่นิวคลีโอไทด์ จะถูกบำบัดแยกกันด้วยเอนไซม์ 2 ชนิด ได้แก่ Bste II และ Нае III จากนั้นใช้การวิเคราะห์ทางอิเล็กโทรโฟรีซิสเจลอะกาโรสเพื่อวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ทั้งสองที่ได้ โดยกำหนดขนาด (จำนวนคู่นิวคลีโอไทด์) โดยใช้ชุดชิ้นส่วน DNA มาตรฐาน (เครื่องหมาย DNA โมเลกุล) ที่มีความยาว 100 ถึง 1,000 คู่นิวคลีโอไทด์ ในแต่ละสปีชีส์ที่กำหนด (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) จะพบชิ้นส่วน DNA 2 หรือ 3 ชิ้นที่มีขนาดต่างกันสำหรับเอนไซม์ตัดจำเพาะแต่ละตัว การรวมกันของชิ้นส่วน DNA ที่ได้ซึ่งมีขนาดต่างกันทำให้สปีชีส์เหล่านี้สามารถแยกแยะออกจากกัน

กำลังมีการพัฒนาเทคโนโลยีสำหรับไมโครอาร์เรย์ DNA ทางชีววิทยาซึ่งจะช่วยระบุไมโคแบคทีเรียได้มากกว่า 100 สายพันธุ์ในการศึกษาครั้งเดียว

การระบุชนิดยังดำเนินการได้โดยใช้การขยาย PCR ของบริเวณแปรผันของ 16S rRNA ตามด้วยการจัดลำดับของแอมพลิคอนเมื่อเปรียบเทียบกับโครงสร้างหลักที่สอดคล้องกัน ซึ่งทำให้สามารถระบุไมโคแบคทีเรียได้มากกว่า 40 สายพันธุ์

PCR ยังสามารถใช้เพื่อระบุสปีชีส์ภายในกลุ่มแบคทีเรียมวัณโรคได้ ซึ่งรวมถึงการแยกความแตกต่างระหว่าง M. bovis และ M. bovis BCG ซึ่งทำได้โดยวิเคราะห์การมีอยู่หรือไม่มีอยู่ของยีนบางตัวในบริเวณจีโนม RD1, RD9 และ RD10 RD1 ไม่มีอยู่ใน M. bovis BCG แต่พบในสปีชีส์ที่ก่อโรคได้ รวมถึง M. bovis

การตรวจสอบความไวต่อยาของเชื้อ Mycobacterium tuberculosis โดยใช้ PCR

หน้าที่ของวิธีการทางพันธุศาสตร์โมเลกุลในการกำหนดความไวหรือความต้านทานต่อยาของเชื้อวัณโรคลดลงเหลือเพียงการระบุการกลายพันธุ์ในลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของยีนที่รู้จัก วิธีการหลักๆ จะขึ้นอยู่กับการอ่านโดยตรง (การจัดลำดับ) ของลำดับเหล่านี้หลังจากการขยายพันธุ์ หรือขึ้นอยู่กับไฮบริดิเซชันของชิ้นส่วน DNA ที่มีฉลากไบโอตินซึ่งขยายพันธุ์ระหว่าง PCR กับโพรบ DNA ทั้งสองทางเลือกเกี่ยวข้องกับการระบุการแทนที่ในลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เมื่อใช้โพรบ DNA จะทำให้ไม่มีหรือไฮบริดิเซชันไม่สมบูรณ์บนเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสโดยใช้เอนไซม์คอนจูเกต (สเตรปตาวิดิน-ฟอสฟาเตสอัลคาไลน์) - วิธี LIPA-Rif-TB

วิธีการวัดการเรืองแสงในโพรบ DNA ที่ตรึงไว้เฉพาะที่บนไมโครรีเจียนที่เสริมกับการกลายพันธุ์ที่ทราบในบริเวณยีนที่ขยายด้วย PCR ซึ่งรับผิดชอบต่อความไวหรือความต้านทานต่อยา เรียกว่าวิธีไมโครไบโอชิป อัลกอริทึมพื้นฐานสำหรับการดำเนินการศึกษานี้มีดังนี้ หลังจากแยก DNA ออกจากตัวอย่างทางคลินิกหรือวัฒนธรรมไมโคแบคทีเรียแล้ว จะต้องดำเนินการ PCR เพื่อขยายชิ้นส่วนที่สอดคล้องกันของยีน groB ที่รับผิดชอบต่อความไวต่อยาต่อไรแฟมพิซิน หรือยีน katG และ inhA ที่เข้ารหัสโปรตีนไมโคแบคทีเรียที่รับผิดชอบต่อความไวต่อไอโซไนอาซิด ผล PCR จะได้รับการประเมินโดยใช้อิเล็กโทรโฟรีซิสเจลอะกาโรส ซึ่งยืนยันการรับชิ้นส่วน DNA ที่สอดคล้องกันที่มีความยาวตามต้องการ จากนั้นดำเนินการ PCR รอบที่ 2 เพื่อใส่ฉลากเรืองแสงลงใน DNA ผล PCR จะได้รับการยืนยันอีกครั้งด้วยอิเล็กโทรโฟรีซิสเจล หลังจากนั้นจะดำเนินการไฮบริดิเซชัน (ฟักข้ามคืน) จากนั้นล้างวัสดุที่ได้บนไบโอชิป ซึ่งเป็นห่วงโซ่ดีเอ็นเอสั้นจำนวนมาก (โพรบ) ที่ยึดไว้บนแผ่นแก้วขนาดเล็กซึ่งเสริมกับลำดับนิวคลีโอไทด์ของเชื้อวัณโรคชนิดไวต่อยาที่จุดที่อาจกลายพันธุ์ได้ รวมถึงลำดับกลายพันธุ์ที่รับผิดชอบต่อการดื้อยา ตำแหน่งของโพรบดีเอ็นเอบนแผ่นจะถูกกำหนดอย่างเคร่งครัด และระดับการเรืองแสงที่สังเกตได้ระหว่างไฮบริดิเซชันเพื่อกำหนดผลลัพธ์โดยใช้เครื่องมืออ่านพิเศษจะถูกกำหนดขึ้น ในเรื่องนี้ ผลการวิเคราะห์จะถูกกำหนดโดยใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์พิเศษ

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มีการพัฒนาวิธีทางเลือกสำหรับการตรวจสอบความไวของยา Mycobacterium tuberculosis โดยใช้เทคโนโลยี real-time PCR ซึ่งทำให้สามารถดำเนินการศึกษาเหล่านี้ได้ในหลอดทดลองแบบปิด

รูปที่ 13-13 แสดงผลการวิเคราะห์การเพาะเชื้อทางคลินิกของเชื้อวัณโรคในการกำหนดความต้านทานต่อยาริแฟมพิซินโดยใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบเรียลไทม์: 218 ตัวอย่างควบคุม (ไวต่อไรแฟมพิซิน); 93 ตัวอย่างควบคุมเชิงบวกสำหรับการกลายพันธุ์ Ser-Trp TCG-TGG; 4482 ตัวอย่างควบคุมเชิงบวกสำหรับการกลายพันธุ์ Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 ตัวอย่างทดลอง ผลการคำนวณกราฟจลนศาสตร์ของการขยายพันธุ์สำหรับ 4 ช่อง: ช่อง 1: 393 ตัวอย่างควบคุมเชิงบวกสำหรับการกลายพันธุ์ Ser-Trp TCG-TGG; ช่อง 2: 4482 ตัวอย่างควบคุมเชิงบวกสำหรับการกลายพันธุ์ Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 ตัวอย่างทดลอง; ช่อง 4: กราฟจลนศาสตร์ของการขยายพันธุ์ของตัวอย่างทั้งหมดที่เข้าร่วมการทดลอง การควบคุมเชิงบวกของปฏิกิริยาการขยายพันธุ์ บทสรุป: การวิเคราะห์พบการกลายพันธุ์ต่อไปนี้ที่มีผลต่อการดื้อยาริแฟมพิซิน: ในตัวอย่าง 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG หลักการเดียวกันนี้ใช้เพื่อตรวจสอบการดื้อยาไอโซไนอาซิดโดยยีน katG และ inhA ซึ่งกำหนดการกลายพันธุ์ที่เกิดขึ้นบ่อยที่สุด

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

การระบุสายพันธุ์ของเชื้อ Mycobacterium tuberculosis

วิธีการระบุสายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคที่ได้รับการศึกษามากที่สุดคือเทคโนโลยีที่เรียกว่า RFLP (striction fragment length polymorphism) ซึ่งอาศัยการแตกตัว (การจำกัด) ดีเอ็นเอของเชื้อวัณโรคด้วยเอนไซม์ Pvu II และไฮบริดิเซชันที่ตามมาของชิ้นส่วนที่ได้กับลำดับเฉพาะบางอย่างบนดีเอ็นเอขององค์ประกอบซ้ำ IS6110 ความแปรปรวนภายในสายพันธุ์เกิดขึ้นเนื่องจากจำนวนซ้ำของ IS6110 ที่แตกต่างกันและตำแหน่งบนดีเอ็นเอ รวมถึงความหลากหลายของระยะทางระหว่างจุดโจมตีบางจุดของเอนไซม์จำกัด (ไซต์จำกัด) และองค์ประกอบ IS6110 เทคโนโลยีนี้มีความซับซ้อนและต้องใช้แรงงานมาก หลังจากบำบัดดีเอ็นเอที่แยกได้จากวัฒนธรรมของแบคทีเรียมวัณโรคด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะแล้ว จะทำการวิเคราะห์ด้วยเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส จากนั้นจึงถ่ายโอนชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีความยาวต่างกันไปยังเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส ผสมกับชิ้นส่วนขององค์ประกอบ IS6110 จากนั้นจึงตรวจหาผลลัพธ์โดยใช้ปฏิกิริยาทางเอนไซม์ รูปแบบแถบเฉพาะที่ได้จะระบุดีเอ็นเอของสายพันธุ์ของแบคทีเรียมวัณโรคเฉพาะ การวิเคราะห์ด้วยคอมพิวเตอร์จะเผยให้เห็นเอกลักษณ์หรือความสัมพันธ์ของสายพันธุ์ แม้ว่าวิธี RFLP จะแยกแยะได้มากที่สุด กล่าวคือ เผยให้เห็นความแตกต่างมากที่สุดในสายพันธุ์ที่วิเคราะห์ แต่ก็ไม่ได้ผล เนื่องจากมีการทำซ้ำ IS6110 เพียงเล็กน้อย (น้อยกว่า 5 ครั้ง) ซึ่งสังเกตได้ในสายพันธุ์บางสายพันธุ์ รูปที่ 13-14 แสดงผลลัพธ์ของการพิมพ์ RFLP ของสายพันธุ์

วิธีอื่นอาจเป็นวิธีสโปลิโกไทป์ - การวิเคราะห์พหุสัณฐานของลำดับดีเอ็นเอสเปเซอร์ - เป็นตัวกลางระหว่างการทำซ้ำโดยตรงของบริเวณ DR เมื่อทำสโปลิโกไทป์ของสายพันธุ์ จะทำ PCR ด้วยไพรเมอร์ที่จำกัดบริเวณ DR หลังจากนั้นจึงสร้างชิ้นส่วนที่มีความยาวต่างกัน ซึ่งผสมกับบริเวณดีเอ็นเอตัวกลางที่แปรผัน การวิเคราะห์ลำดับสเปเซอร์ของบริเวณ DR ดูเหมือนจะง่ายกว่า มีประสิทธิผลมากกว่า และเหมาะสมสำหรับการคัดกรองสายพันธุ์เบื้องต้นและการวิเคราะห์ทางระบาดวิทยาเบื้องต้น รวมถึงการศึกษาวัสดุทางคลินิกโดยตรง

เห็นได้ชัดว่าวิธีการที่มีประสิทธิภาพและเข้าถึงได้ด้วยเทคโนโลยีมากกว่าคือ VNTR (ย่อมาจากคำภาษาอังกฤษ) หรือวิธีการกำหนดจำนวนซ้ำของแทนเด็มที่แน่นอนใน DNA ของแบคทีเรียไมโคแบคทีเรียมทูเบอร์คูโลซิส วิธีนี้ใช้เฉพาะ PCR เท่านั้นและไม่ต้องการการปรับเปลี่ยนเพิ่มเติม เนื่องจากจำนวนซ้ำของแทนเด็มในสายพันธุ์และตำแหน่งต่างๆ แตกต่างกัน จึงมีการกำหนดและวิเคราะห์ชิ้นส่วนที่มีขนาดต่างกันบนอิเล็กโทรโฟเรแกรมของผลิตภัณฑ์ PCR ที่ได้ นักวิจัยกล่าวว่าด้วยความช่วยเหลือของ VNTR ทำให้สามารถแยกแยะสายพันธุ์ได้ดีกว่าวิธี RFLP

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมามีการให้ความสนใจอย่างมากในการแพร่กระจายของเชื้อ Mycobacterium tuberculosis ในตระกูล W-Beijing (บางครั้งเรียกว่าสายพันธุ์ปักกิ่ง) ซึ่งส่วนใหญ่ดื้อยา

ข้อกำหนดพื้นฐานสำหรับคุณภาพการวิจัยทางชีววิทยาโมเลกุล

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

เอกสารกำกับหลักการทำ PCR

คำสั่งของกระทรวงสาธารณสุขแห่งสหพันธรัฐรัสเซีย: ฉบับที่ 45 ลงวันที่ 7.02.2000 ฉบับที่ 109 ลงวันที่ 21.03.2003 ฉบับที่ 64 ลงวันที่ 21.02.2000 แนวปฏิบัติ: 1.3.1888-04 "การจัดระเบียบการทำงานระหว่างการวิจัย PCR ของวัสดุที่ติดเชื้อจุลินทรีย์กลุ่มก่อโรค III-IV" 1.3.1794-03 "การจัดระเบียบการทำงานระหว่างการวิจัย PCR ของวัสดุที่ติดเชื้อจุลินทรีย์กลุ่มก่อโรค I-II" 2003 3.5.5.1034-01 "การฆ่าเชื้อวัสดุทดสอบที่ติดเชื้อแบคทีเรียกลุ่มก่อโรค I-IV เมื่อทำงานกับวิธี PCR" 2001 ภาคผนวก 11 ของคำแนะนำเกี่ยวกับวิธีการรวมของการวิจัยทางจุลชีววิทยาในการตรวจจับการวินิจฉัยและการรักษาโรควัณโรค

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

พนักงาน

การศึกษาทางชีววิทยาระดับโมเลกุลอาจดำเนินการได้โดยแพทย์วินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการทางคลินิก นักแบคทีเรียวิทยา นักไวรัสวิทยา นักชีววิทยาห้องปฏิบัติการวินิจฉัยทางคลินิก ตลอดจนผู้เชี่ยวชาญที่มีการศึกษาทางการแพทย์ระดับรองซึ่งได้ผ่านความเชี่ยวชาญและการฝึกอบรมขั้นสูงในลักษณะที่กำหนดไว้

การจัดสถานที่ห้องปฏิบัติการ

ต้องมีห้องปฏิบัติการดังต่อไปนี้:

• พื้นที่การประมวลผลตัวอย่าง - ห้องปฏิบัติการที่ได้รับการดัดแปลงสำหรับการทำงานกับตัวก่อโรคระดับความก่อโรค III-IV ตามแนวทางเชิงวิธีการ 13.1888-04
• พื้นที่สำหรับเตรียมส่วนผสมปฏิกิริยา PCR คือห้องปฏิบัติการที่ให้การป้องกันการปนเปื้อนภายในห้องปฏิบัติการ - พื้นที่ “สะอาด”
• • หากใช้การวิเคราะห์ด้วยอิเล็กโตรโฟเรซิสหรือไฮบริดิเซชันในการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ PCR ห้องปฏิบัติการที่แยกชิ้นส่วน DNA ที่ขยายแล้วออกจากหลอดขยาย จะต้องแยกออกจากสภาพแวดล้อมโดยสมบูรณ์ตามข้อกำหนดสำหรับห้องปฏิบัติการ PCR (แนวทางวิธีการ 1.3.1794-03, แนวทางวิธีการ 1.3.1888-04) ต้องแยกออกจากห้องที่ระบุไว้ในย่อหน้าก่อนหน้าอย่างสมบูรณ์ ห้ามเคลื่อนย้ายบุคลากร อุปกรณ์ วัสดุ และวัตถุใดๆ จากพื้นที่การวิเคราะห์ด้วยอิเล็กโตรโฟเรซิสไปยังพื้นที่ประมวลผลตัวอย่างและพื้นที่ "สะอาด" รวมถึงการถ่ายเทอากาศผ่านระบบระบายอากาศหรือเป็นผลจากลมพัด พื้นที่นี้ไม่จำเป็นสำหรับการตรวจจับฟลูออไรเมตริกของผลิตภัณฑ์ PCR
• ห้องบันทึกข้อมูลและประมวลผลผลมีคอมพิวเตอร์และอุปกรณ์สำนักงานที่จำเป็น ห้องนี้อาจมีอุปกรณ์ที่ตรวจจับผลิตภัณฑ์ PCR ได้โดยไม่ต้องเปิดหลอด - เครื่องตรวจจับ PCR แบบเรืองแสงและเครื่องปั่นความร้อนสำหรับ PCR แบบเรียลไทม์

ข้อกำหนดด้านสุขอนามัยและระบาดวิทยาสำหรับการประมวลผลเสมหะขั้นต้นนั้นคล้ายคลึงกับข้อกำหนดด้านจุลชีววิทยามาตรฐานสำหรับการทำงานกับเชื้อ Mycobacterium tuberculosis

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

ชุดอุปกรณ์ห้องปฏิบัติการครบชุดสำหรับการวินิจฉัยด้วย PCR

ชุดห้องปฏิบัติการประกอบด้วยอุปกรณ์สำหรับห้องต่อไปนี้

• ห้องเตรียมตัวอย่าง ประกอบด้วยอุปกรณ์ดังต่อไปนี้: เครื่องดูดควันแบบลามินาร์ป้องกันระดับ II "SP-1.2": เทอร์โมสตัทโซลิดสเตตพร้อมฝาปิดอุ่นสำหรับหลอดทดลอง Eppendorf; ไมโครเซนตริฟิวจ์ 13,000 รอบต่อนาที; เครื่องปั่นเหวี่ยง ("Vortex"); ตู้เย็นที่มีช่วงอุณหภูมิตั้งแต่ -20 ^° C ถึง +10 ^° C; ปิเปตปริมาตรแปรผันของซีรีส์ "Proline"; ปั๊มพร้อมขวดดัก OM-1; ชั้นวางปิเปต; ชั้นวางสถานีงาน 200x0.5 มล.; ชั้นวางสถานีงาน 50x1.5 มล.; ชั้นวางสำหรับจัดเก็บหลอดทดลอง 80x1.5 มล.;
• ห้องเตรียมส่วนผสมปฏิกิริยา: กล่องป้องกัน PCR ("Laminar-C. 110 ซม.); เครื่องปั่นเหวี่ยง "Vortex"; ปิเปตปริมาตรแปรผันของซีรีส์ "Proline"; ชั้นวางปิเปต; ชั้นวางเวิร์กสเตชัน 200x0.2 มล.; ชั้นวางสำหรับจัดเก็บหลอดทดลอง 80x1.5 มล.; ตู้เย็นที่มีช่วงอุณหภูมิตั้งแต่ -20 ^° C ถึง +10 ^° C;
• ห้องอิเล็กโทรโฟเรซิส: ห้องอิเล็กโทรโฟเรซิสแนวนอน; แหล่งพลังงาน; ทรานส์อิลลูมิเนเตอร์;
• เครื่องขยายสัญญาณดีเอ็นเอหรือเครื่องวิเคราะห์กรดนิวคลีอิก (เรียลไทม์พีซีอาร์) พร้อมคอมพิวเตอร์และซอฟต์แวร์ สามารถติดตั้งได้ในห้องใดก็ได้ หากใช้เทคโนโลยีเรียลไทม์พีซีอาร์ ไม่จำเป็นต้องมีห้องอิเล็กโทรโฟรีซิส

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

การควบคุมคุณภาพภายนอก

เพื่อให้แน่ใจว่าจะได้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้อย่างเป็นรูปธรรม ห้องปฏิบัติการจะต้องมีส่วนร่วมในระบบการประเมินภายนอกเกี่ยวกับคุณภาพของการวิจัยในห้องปฏิบัติการ

ผู้เข้าร่วมในระบบการควบคุมคุณภาพจะได้รับ: 12 แอมเพิลที่มีสารแขวนลอยของเซลล์แบคทีเรียชนิดแห้งเยือกแข็ง 2 แอมเพิลที่มีเชื้อวัณโรคไมโคแบคทีเรียม 3 แอมเพิล (สายพันธุ์เอเวียเลนต์) ที่ความเข้มข้น 10 ² /มล. 3 แอมเพิลที่มีเซลล์ของสายพันธุ์ที่คล้ายคลึงกันที่ความเข้มข้น 10 ⁴ /มล. 2 แอมเพิลที่มีเชื้อไมโคแบคทีเรียมที่ไม่ใช่วัณโรค M. avium-intracellulare และ M. kansasii ที่ความเข้มข้น 10 ⁵ /มล. อย่างละ 2 แอมเพิล

การทดสอบที่ส่งออกไปเพื่อการประเมินคุณภาพภายนอกได้รับการทดสอบล่วงหน้าในห้องปฏิบัติการอิสระสองแห่งซึ่งมีประสบการณ์มากมายในสาขานี้

[ 85 ], [ 86 ]