เซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อน

การค้นพบเซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อนไม่ได้เกิดขึ้นโดยบังเอิญ แต่เกิดขึ้นบนพื้นที่ที่เตรียมไว้สำหรับการวิจัยทางวิทยาศาสตร์ในสาขาชีววิทยาการพัฒนา คำว่า "เซลล์ต้นกำเนิด" ถูกนำมาใช้ในทางการแพทย์ในปี 1908 ที่การประชุมของสมาคมโลหิตวิทยาในกรุงเบอร์ลินโดย Alexander Maximov ซึ่งเกี่ยวข้องกับเซลล์เม็ดเลือด ก่อนที่จะมีการแยกและผลิตเซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อนที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงรูปร่างได้หลายแบบ เซลล์ต้นกำเนิดเทอราโต (เซลล์มะเร็งตัวอ่อน) ถูกนำมาใช้ในการศึกษาขั้นตอนการพัฒนาในระยะเริ่มต้น ซึ่งด้วยความช่วยเหลือของเซลล์ต้นกำเนิดเหล่านี้ กลไกที่ยังไม่เป็นที่รู้จักของการสร้างตัวอ่อนจึงถูกศึกษา รวมถึงลำดับการแสดงออกของยีนในระยะเริ่มต้นและผลิตภัณฑ์โปรตีนของกิจกรรมของยีนเหล่านั้น

แต่ความสามารถในการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดของจีโนมมนุษย์นั้นสูญหายไปอย่างถาวรในกระบวนการวิวัฒนาการหรือไม่? ไม่เลย และการเกิดตัวอ่อนก็เป็นเครื่องพิสูจน์เรื่องนี้ หากเป็นเช่นนั้น เมื่อใดจึงจะเกิดเส้นทางวิวัฒนาการที่สองได้? อาจเป็นเมื่อมนุษย์เข้าสู่อวกาศ ซึ่งสภาพแวดล้อมจะค่อนข้างคงที่เป็นเวลานานพอสมควร การสูญเสียเนื้อเยื่อกระดูก (การสูญเสียแร่ธาตุของกระดูกในสภาวะไร้น้ำหนัก) ซึ่งค่อย ๆ ถูกปรับเปลี่ยนและสร้างใหม่ อาจถือเป็นขั้นตอนแรกในกระบวนการปรับตัวของมนุษย์ในฐานะสปีชีส์ให้ดำรงชีวิตในอวกาศได้ อย่างไรก็ตาม ราคาของเส้นทางวิวัฒนาการที่สองนั้นจะแตกต่างกันออกไป โดยราคาสำหรับการกลับมาของความสามารถในการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดและความยืดหยุ่นอย่างสมบูรณ์ของเซลล์ทั้งหมดจะเป็นการไม่มีบุตร ดังนั้น ในโลกของ "กิ้งก่าวิวัฒนาการ" นี้ เราจะต้องสืบพันธุ์โดยไม่แบ่งตัวแบบไมโอซิส แต่เราจะมีชีวิตอยู่ได้นาน ความเป็นอมตะของเทโลเมอเรสคือความเป็นอมตะของอะมีบา ในสิ่งมีชีวิตหลายเซลล์ เซลล์ต้นกำเนิดเป็นพื้นฐานของอายุยืนทั้งเชิงปริมาณและเชิงคุณภาพ

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

แหล่งที่มาของเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน

ปัจจุบัน แหล่งที่มาของเซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อนสำหรับการวิจัยในห้องปฏิบัติการ ได้แก่ เซลล์มะเร็งเทอราโตคาร์ซิโนมาของหนู (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) และเซลล์มะเร็งเทอราโตคาร์ซิโนมาของมนุษย์ (NTERA-2, TERA-2, โคลน H-9) รวมถึงเซลล์มะเร็งเทอราโตคาร์ซิโนมาของ Trauneon อย่างไรก็ตาม การมีพาสปอร์ตเซลล์โดยละเอียดซึ่งระบุถึงลักษณะทางภูมิคุ้มกัน ผลการวิเคราะห์โครโมโซม โปรไฟล์การแสดงออกของ mRNA ตัวรับที่เปิดเผย และโปรตีนส่งสัญญาณภายในเซลล์ ไม่สามารถชดเชยข้อบกพร่องที่สำคัญของเซลล์มะเร็งเทอราโตคาร์ซิโนมา ESC ได้ เช่น การสูญเสียความสามารถในการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดอย่างรวดเร็วและไม่สามารถนำไปใช้ในการทดลองทางคลินิกได้ ในขณะที่การแยกความแตกต่างแบบผสมในวัฒนธรรมทำให้การแยกเซลล์เฉพาะทางที่บริสุทธิ์จากประชากรเซลล์ที่มีความหลากหลายเป็นเรื่องยากมาก ดังนั้น แหล่งที่มาของสาย ESC ที่สร้างขึ้นเพื่อวัตถุประสงค์ทางคลินิกมักเป็นมวลเซลล์ภายในของระยะบลาสโตซิสต์ บลาสโตเมียร์แต่ละอันของเอ็มบริโอระยะ 8 เซลล์ เซลล์มอรูลาในระยะหลังๆ รวมไปถึงเซลล์เชื้อพันธุ์ดั้งเดิม

ควรสังเกตว่าเซลล์เทอราโตคาร์ซิโนมาแม้จะมีคุณสมบัติในการแปลงพันธุกรรมได้ แต่ก็มีศักยภาพในการแปลงพันธุกรรมได้ต่ำกว่าเซลล์ ESC อย่างมีนัยสำคัญ การรวมตัวกับเซลล์ตัวอ่อนไม่ค่อยนำไปสู่การสร้างไคเมร่า ซึ่งยิ่งไปกว่านั้นจะไม่สร้างเซลล์สืบพันธุ์ที่มีจีโนไทป์ของเซลล์เทอราโตคาร์ซิโนมา เชื่อกันว่าสาเหตุเกิดจากความผิดปกติของโครโมโซมที่เกิดขึ้นบ่อยครั้งระหว่างการเพาะเลี้ยงเซลล์เทอราโตคาร์ซิโนมา เช่น การสูญเสียโครโมโซม Y การเกิดทริโซมี การลบออก หรือการเคลื่อนย้าย

มีการพยายามแยกสายพันธุ์ ESC ของมนุษย์ซ้ำแล้วซ้ำเล่า แต่ภารกิจนี้ยังไม่ได้รับการแก้ไข เนื่องจากการเข้าถึงบลาสโตซิสต์ของมนุษย์ปกติทำได้ยาก นอกจากนี้ ความถี่ของความผิดปกติของโครโมโซมในมนุษย์ยังสูงกว่าการเกิดเอ็มบริโอของสัตว์ เอ็มบริโอของมนุษย์ในระยะแรกส่วนใหญ่ที่ได้รับหลังจากการปฏิสนธิในหลอดแก้วจะแสดงอาการโมเสกโครโมโซมแบบสับสนและมักมีความคลาดเคลื่อนทางตัวเลขและโครงสร้าง แม้ในภายหลัง ในระยะบลาสโตซิสต์ มีเพียง 20-25% ของเอ็มบริโอของมนุษย์เท่านั้นที่มีเซลล์ที่มีแคริโอไทป์ปกติ แทบจะเป็นไปไม่ได้เลยที่จะใช้เอ็มบริโอดังกล่าวเพื่อสร้าง ESC เนื่องจากโดยปกติแล้วจะมีการเพาะเลี้ยงไซโกตจนถึงระยะบลาสโตซิสต์สองหรือสี่ระยะแล้วจึงย้ายเข้าไปในมดลูก เมื่อไม่นานมานี้เองที่มีการพัฒนาเทคนิคที่เชื่อถือได้สำหรับการเพาะเลี้ยงไข่ของมนุษย์ที่ได้รับการผสมแล้วจนถึงระยะบลาสโตซิสต์ การนำเทคนิคนี้มาใช้ในปฏิบัติการปฏิสนธิในหลอดทดลองไม่เพียงแต่ช่วยเพิ่มความถี่ของผลลัพธ์การฝังตัวที่ประสบความสำเร็จเท่านั้น แต่ยังทำให้ระยะบลาสโตซิสต์ปกติกลายเป็นวัตถุที่เข้าถึงได้ง่ายขึ้นอีกด้วย

แหล่งเซลล์ต้นกำเนิดที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างอีกแหล่งหนึ่งคือเซลล์เชื้อพันธุ์ดั้งเดิม ซึ่งต่างจากกลุ่มเซลล์ต้นกำเนิดขั้นสูงของเยื่อบุผิวเชื้อพันธุ์ เซลล์เชื้อพันธุ์ดั้งเดิมไม่มีเบตาอินทิกรินอยู่บนพื้นผิว แต่แสดงกิจกรรมฟอสฟาเตสอัลคาไลน์สูง ควรสังเกตว่ากลุ่มเซลล์ต้นกำเนิดที่ก่อตัวจากเซลล์เชื้อพันธุ์ดั้งเดิมได้รับการศึกษาทดลองมาตั้งแต่ทศวรรษ 1980 ในเวลานั้น มีการพัฒนาวิธีการแยกเซลล์เชื้อพันธุ์ดั้งเดิมจากต่อมเพศพื้นฐานของตัวอ่อนของหนู ผลลัพธ์ที่ไม่ประสบความสำเร็จครั้งแรกของการเพาะเลี้ยงเซลล์เชื้อพันธุ์ดั้งเดิมในหลอดทดลองชี้ให้เห็นว่าความพยายามเหล่านี้ไร้ประโยชน์ เนื่องจากแม้ว่าเซลล์จะรอดชีวิต แต่ก็ไม่แพร่พันธุ์และตายภายในวันแรก ต่อมาได้มีการพิสูจน์ว่าเซลล์เชื้อพันธุ์ดั้งเดิมของหนูจะขยายพันธุ์ในหลอดทดลองได้ก็ต่อเมื่อมีปัจจัยการเจริญเติบโตของโพลีเปปไทด์เฉพาะที่ละลายน้ำได้และถูกผูกติดกับเยื่อหุ้มเซลล์ในอาหารเลี้ยงเชื้อเท่านั้น ผลการศึกษาจำนวนมากแสดงให้เห็นว่า เพื่อการอยู่รอดและการขยายพันธุ์ของเซลล์เชื้อพันธุ์หลัก จำเป็นต้องมีไม่เพียงแค่ LIF เท่านั้น แต่ยังต้องมีปัจจัยเหล็ก (SIF) ที่ผูกติดกับเยื่อหุ้มเซลล์และละลายน้ำได้ (SIF) ในอาหารเลี้ยงเชื้อด้วย เปปไทด์เหล่านี้ผลิตขึ้นโดยเซลล์โซมาติกของเอ็มบริโอที่มีการกลายพันธุ์แบบเหล็ก และหนึ่งในนั้นคือลิแกนด์ของโปรโตออนโคยีน cKit

เซลล์สืบพันธุ์หลักของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและมนุษย์มีต้นกำเนิดจากนอกอัณฑะและเป็นแหล่งกำเนิดของการพัฒนาโคลนของเซลล์สืบพันธุ์ ต้นกำเนิดของเซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิม รวมถึงเนื้อเยื่อของตัวอ่อนทั้งหมดและเมโซเดิร์มนอกตัวอ่อนคือเอพิบลาสต์ (เอ็กโทเดิร์มหลัก) ของตัวอ่อนระยะแรก ซึ่งมีโครงสร้างแบบโมเสก โดยใช้การผ่าตัดเอาส่วนต่างๆ ของตัวอ่อนระยะแรกออก โซนเฉพาะที่ในเอพิบลาสต์ของโคลนของเซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมที่ถูกสร้างขึ้น โดยใช้โรดามีนเดกซ์แทรน ซึ่งใช้เป็นเครื่องหมายเซลล์ พบว่าเซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมจะอยู่ในบริเวณใกล้เคียงของเอพิบลาสต์ ใกล้กับเอ็กโทเดิร์มนอกตัวอ่อน เซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมเกิดจากโคลน 45 เซลล์ ซึ่งการจัดสรรเกิดขึ้นในช่วงเริ่มต้นของการสร้างตัวอ่อน จากนั้นโคลนจะแยกตัว และในระหว่างการสร้างตัวอ่อน เซลล์สืบพันธุ์หลักจะเข้าสู่เมโสเดิร์มนอกตัวอ่อนและพบที่ฐานของรูดิเมนต์อัลลันทอยส์ หลังแถบหลัก จากนั้น เซลล์สืบพันธุ์หลักจะอพยพไปทางส่วนท้องของเอ็นโดเดิร์มของลำไส้ส่วนหลัง จากนั้นจึงเคลื่อนที่อย่างแข็งขันไปตามเมเซนเทอรี โดยเข้าไปอยู่ในสันอวัยวะเพศเมื่อสิ้นสุดการอพยพ ในระหว่างการอพยพ เช่นเดียวกับในช่วง 2-3 วันแรกของตำแหน่งในรูดิเมนต์ต่อมเพศ เซลล์สืบพันธุ์หลักจะขยายพันธุ์อย่างแข็งขันและดำเนินวงจรการจำลองแบบ 8 รอบ หากในช่วงเริ่มต้นของการอพยพมีเซลล์สืบพันธุ์หลักประมาณ 50 เซลล์ ในสันอวัยวะเพศของตัวอ่อนของหนูที่มีอายุ 12 วันของการพัฒนา จำนวนเซลล์สืบพันธุ์หลักจะเกิน 25,000 เซลล์

ความคล้ายคลึงกันในการทำงานของเซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมและเซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมนั้นเห็นได้จากการผสานรวมอย่างสมบูรณ์ของเซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมเข้าสู่ระยะบลาสโตซิสต์ด้วยการแทนที่มวลเซลล์ภายในและการพัฒนาเต็มรูปแบบของตัวอ่อนซึ่งเนื้อเยื่อประกอบด้วยลูกหลานของเซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมเท่านั้น ในคุณสมบัติอื่นๆ เซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมของหนูก็ปรากฏว่าเหมือนกับเซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมทุกประการ โดยแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการแยกความแตกต่างในทิศทางต่างๆ เพื่อสร้างร่างกายของเอ็มบริออยด์ในหลอดทดลอง และสร้างเทอราโทมาในร่างกายเมื่อฉีดเข้าใต้ผิวหนังในหนูที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง ซึ่งคล้ายกับเทอราโทมาของอัณฑะที่เกิดขึ้นเองในหนู 129/ter

พบว่าเมื่อเติม LIF, SIF ที่ผูกกับเยื่อหุ้มเซลล์และละลายน้ำได้ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ เซลล์เชื้อหลักที่แยกได้จากตัวอ่อนของหนูอายุ 8 วันจะอยู่รอดและสืบพันธุ์ในวัฒนธรรมได้ 4 วัน แต่หลังจากนั้นจะตาย นอกจากนี้ ช่วงเวลาที่สังเกตเห็นการตายของเซลล์เชื้อหลักในวัฒนธรรมนั้นตรงกับระยะการพัฒนาของตัวอ่อนของหนู (12.5-13.5 วัน) เมื่อเซลล์เชื้อหลักเพศเมียเข้าสู่ระยะไมโอซิสที่บริเวณพื้นฐานของต่อมเพศ และการแบ่งไมโทซิสจะถูกบล็อกในเซลล์เชื้อหลักเพศผู้ อย่างไรก็ตาม หากไม่เพียงเติมปัจจัยการเจริญเติบโต LIF และ SIF เท่านั้น แต่ยังเติม FGF2 ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ เซลล์เชื้อหลักจะยังคงแพร่พันธุ์ต่อไป และกลุ่มเซลล์ที่สามารถขยายพันธุ์ได้แม้จะเอาปัจจัยการเจริญเติบโต (SIF และ FGF) ออกจากอาหารเลี้ยงเชื้อแล้ว ก็จะก่อตัวขึ้นในอาหารเลี้ยงเชื้อย่อย เซลล์ดังกล่าวสามารถเพาะเลี้ยงได้เป็นเวลานานบนพื้นผิวของไฟโบรบลาสต์ของตัวอ่อนโดยไม่ต้องเติมปัจจัยการเจริญเติบโตที่ละลายน้ำได้ LIF มีการเสนอให้เรียกเซลล์สายพันธุ์เสถียรเหล่านี้ซึ่งได้มาจากเซลล์เชื้อพันธุ์ดั้งเดิมว่าเซลล์เชื้อพันธุ์ของตัวอ่อน คำศัพท์นี้ไม่ประสบความสำเร็จเลย เนื่องจากไม่สามารถเรียกเซลล์เชื้อพันธุ์ของตัวอ่อนที่มีความสามารถในการดำเนินขั้นตอนต่อมาของการสร้างไข่หรือการสร้างสเปิร์มได้เมื่อเพาะเลี้ยงเซลล์ EG เนื่องจากเซลล์ EG แม้ว่าจะมาจากเซลล์เชื้อพันธุ์ดั้งเดิม แต่เมื่อได้รับคุณสมบัติของเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพของตัวอ่อนในการเพาะเลี้ยง เซลล์เหล่านี้ก็จะสูญเสียความสามารถในการสร้างสายเซลล์เชื้อพันธุ์ กล่าวอีกนัยหนึ่ง เซลล์เชื้อพันธุ์ดั้งเดิมเมื่อเพาะเลี้ยงจะสูญเสียคุณสมบัติของเซลล์ตั้งต้นของเซลล์สืบพันธุ์และถูกเปลี่ยนเป็นเซลล์พหุศักยภาพที่คล้ายกับเซลล์ ESC

มีการสังเกตเห็นว่าเทอราโทมาจะไม่เกิดขึ้นเมื่อเซลล์ EG ถูกนำเข้าสู่หนูที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง สันนิษฐานว่าการสูญเสียความสามารถของเซลล์ EG ของมนุษย์ในการเกิดเทอราโทมานั้นเกิดจากความจริงที่ว่าสายเซลล์เหล่านี้ไม่ได้ถูกสร้างขึ้นโดยตรงจากเซลล์เชื้อพันธุ์หลักที่เพาะเลี้ยง แต่ได้รับมาจากเซลล์ที่แยกจากเอ็มบริออยด์บอดี ดังนั้นจึงเป็นไปได้ว่าสายเซลล์เหล่านี้อาจเป็นลูกหลานของเซลล์ที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างแต่มีการสร้างเซลล์แล้ว

ควรสังเกตว่ามีข้อแตกต่างพื้นฐานระหว่างเซลล์ EG และเซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิม เซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมไม่อนุญาตให้ได้รับเอ็มบริโอของหนูไคเมอริก ซึ่งบ่งชี้ถึงการขาดความสามารถของเซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมในการรวมเข้ากับมวลเซลล์ด้านในหรือโทรเฟกโตเดิร์ม ลักษณะเฉพาะของประชากรเซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมนั้นคล้ายคลึงกับสายเซลล์โซมาติกของเอ็มบริโอในภายหลังมากกว่า ซึ่งการนำเซลล์เหล่านี้เข้าสู่ระยะบลาสโตซิสต์ก็ไม่ได้นำไปสู่การสร้างเอ็มบริโอไคเมอริกเช่นกัน

การปรับเปลี่ยนเทคนิคการเพาะเลี้ยงเอ็มบริออยด์บอดีที่ได้จากการรวมกลุ่มของเซลล์ EG ทำให้สามารถได้ประชากรเซลล์ที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างอีกกลุ่มหนึ่งที่เรียกว่า "เซลล์ที่ได้จากเอ็มบริออยด์บอดี" (เซลล์ EBD) โดยใช้การคัดเลือกบนสื่อที่เลือก ความสามารถในการแพร่พันธุ์ของเซลล์ EBD ในวัฒนธรรมเป็นเวลานานทำให้สามารถสร้างสายเซลล์ที่เสถียรของเซลล์ที่มุ่งมั่นได้ โคลนของเซลล์ที่แสดง mRNA ที่หลากหลายและเครื่องหมายโปรตีนของเซลล์เฉพาะทางได้ วิธีการนี้พิสูจน์ในที่สุดว่าเซลล์สืบพันธุ์หลักของมนุษย์มีความสามารถในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างและสามารถแยกความแตกต่างในหลอดทดลองเป็นเซลล์ประเภทต่างๆ ได้แก่ เซลล์ประสาท เซลล์เกลีย เซลล์เยื่อบุหลอดเลือด เซลล์เม็ดเลือด เซลล์กล้ามเนื้อ และเซลล์เยื่อบุผิว

แหล่งทางเลือกของเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน

แหล่งอื่นของสาย ESC ของมนุษย์อาจเป็นเซลล์ลูกผสม การฝังตัวเข้าไปในมดลูกของวัวที่ตั้งครรภ์เทียมที่มีโครงสร้างที่มีความหลากหลายซึ่งได้มาจากการหลอมรวมด้วยไฟฟ้าของเซลล์โซมาติกของทารกในครรภ์มนุษย์กับไข่ของวัวซึ่งเอาส่วนโพรนิวเคลียสออกก่อนหน้านี้ ทำให้สามารถรับมวลเซลล์ภายในจากเอ็มบริโอเทียมจากระยะการพัฒนาก่อนการฝังตัวได้ เพื่อจุดประสงค์นี้ ในระยะแรก จะได้รับบลาสโตซิสต์จากไข่ของวัวที่มีนิวเคลียสเซลล์ของมนุษย์ที่ปลูกถ่าย

ในระยะที่สอง เอ็มบริโอบลาสต์จะถูกแยกออกจากบลาสโตซิสต์ จากนั้นจึงแยกเซลล์ ESC โดยใช้วิธีทอมสัน ที่น่าสังเกตคือ ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดในการแยกสายเซลล์ ESC โดยใช้วิธีนี้คือการใช้เซลล์นิวเคลียสของเซลล์ฟอลลิคิวลาร์หรือเซลล์สืบพันธุ์หลักที่ยังคงอยู่ในร่างกายมนุษย์ในสถานะจำศีล เนื่องจากนิวเคลียสของเซลล์มนุษย์ที่ปลูกถ่ายเข้าไปในไข่วัวจะต้องมีเทโลเมียร์ที่ไม่สั้นลงและมีกิจกรรมเทโลเมียสสูง ซึ่งช่วยหลีกเลี่ยงการแก่ก่อนวัยของโคลน ESC ที่ได้จากไข่ลูกผสม (Repin, 2001) เป็นที่ทราบกันดีว่าโปรตีนมาร์กเกอร์ภายในเซลล์ที่สำคัญที่สุดของ ESC คือ Oct3, Oct4, Tcf, Groucho ซึ่งจัดอยู่ในกลุ่มที่เรียกว่าโปรตีนตัวเก็บเสียงโครมาติน ตัวเก็บเสียงจะให้เฮเทอโรโครมาตินที่แน่นเป็นพิเศษ ซึ่งป้องกันการก่อตัวของลูปยูโครมาติน การบรรจุโครมาตินโดยโปรตีนเหล่านี้สัมพันธ์กับความสามารถในการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดของจีโนม ESC จนถึงปัจจุบันได้มีการพิสูจน์แล้วว่าเซลล์ไข่ของโคและมนุษย์ที่โตเต็มวัยเป็นเซลล์เฉพาะทางชนิดเดียวที่มีโปรตีนที่ทำหน้าที่เก็บเสียงในปริมาณสูงในไซโทพลาซึม จากพื้นฐานนี้ จึงได้มีการพัฒนาวิธีการเพื่อให้ได้เซลล์ต้นกำเนิด ESC แบบไฮบริดโดยการถ่ายโอนนิวเคลียสของเซลล์ร่างกายไปยังเซลล์ไข่ของโคที่ลอกเปลือกออกแล้ว การศึกษาในหลอดทดลองเบื้องต้นแสดงให้เห็นว่าไซโทพลาซึมของโอโอไซต์ของโคสามารถฟื้นฟูความสามารถในการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดของจีโนมนิวเคลียสของเซลล์ร่างกายของมนุษย์ได้หลังจากเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12-24 ชั่วโมง

ข้อมูลที่น่าสนใจเป็นพิเศษเกี่ยวกับลักษณะเฉพาะของการพัฒนาก่อนการฝังตัวของตัวอ่อนมนุษย์นั้นบ่งชี้ว่าเซลล์ต้นกำเนิดจะถูกแทนที่ด้วยเซลล์ที่มีศักยภาพในการแบ่งตัวใหม่ในภายหลังเมื่อเทียบกับในหนู การศึกษาการเปลี่ยนแปลงของเซลล์แสดงให้เห็นว่าเซลล์ trophoblast ยังเกิดจากเซลล์ของมวลเซลล์ด้านในของ blastocyst ของมนุษย์ นอกเหนือจาก ESC ซึ่งบ่งชี้ถึงศักยภาพทั้งหมดของเซลล์เหล่านี้

เป็นที่ทราบกันดีว่าในระยะบลาสโตซิสต์ จะมีกลุ่มเซลล์ที่มีพันธะผูกพันแตกต่างกัน 2 กลุ่มเกิดขึ้น กลุ่มหนึ่งสร้างชั้นนอกของบลาสโตซิสต์ ซึ่งก็คือโทรเฟกโตเดิร์ม โดยอนุพันธ์ของโทรเฟกโตเดิร์มคือเซลล์โทรเฟกโตบลาสต์และส่วนประกอบอื่นๆ ของตัวอ่อนในรก กลุ่มเซลล์ที่สองจะจัดกลุ่มเป็นมวลหนาแน่นที่สัมผัสกับพื้นผิวด้านในของโทรเฟกโตเดิร์ม อนุพันธ์ของประชากรเซลล์ของมวลเซลล์ด้านในเป็นเนื้อเยื่อและพื้นฐานของอวัยวะของตัวอ่อน ในระยะบลาสโตซิสต์ตอนปลาย เอ็นโดเดิร์มนอกตัวอ่อนจะก่อตัวขึ้นจากมวลเซลล์ด้านใน และเอพิบลาสต์ (เอพิบลาสต์หลัก) จะก่อตัวขึ้น ในกรณีนี้ เซลล์เอพิบลาสต์จะยังคงมีความสามารถในการแบ่งตัวของเซลล์ได้ ในขณะที่ความสามารถในการแยกความแตกต่างของเอ็นโดเดิร์มนอกตัวอ่อนนั้นมีจำกัด

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

การได้รับเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนของมนุษย์

จนกระทั่งเมื่อไม่นานมานี้ เชื่อกันว่าเป็นไปไม่ได้ที่จะได้รับ ESC จาก trophoblast อย่างไรก็ตาม เซลล์ต้นกำเนิด trophectoderm ดิพลอยด์ที่แยกได้จากบลาสโตซิสต์จะขยายพันธุ์และเปลี่ยนเป็นเซลล์ต้นกำเนิดในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี FGF2 และเฮปารินแทนที่จะเป็น LIF หาก FGF2 ถูกนำออกจากอาหารเลี้ยงเชื้อ เซลล์ trophectoderm จะหยุดแบ่งตัว โครโมโซมจะเริ่มจำลองแบบเอนโดเรมิคูเลชันในเซลล์ และองค์ประกอบเซลล์ trophectoderm จะค่อยๆ เปลี่ยนเป็นเซลล์ trophoblast ขนาดใหญ่ อาจเป็นไปได้ว่า LIF ไม่ได้กระตุ้นการแพร่พันธุ์ของเซลล์ trophectoderm เนื่องจาก FGF2 กระตุ้นกลไกการส่งสัญญาณแบบทรานส์ที่แตกต่างกัน เนื่องจาก FGF2 ที่จับกับตัวรับในพลาสมา (FGFR2) จะกระตุ้น MAP kinases ในไซโทพลาซึม - ERK1 และ ERK2 ดังนั้น เมื่อเส้นทางการส่งสัญญาณหนึ่งเส้นทาง (LIF - gpl30 - JAK kinase - STAT3) ถูกเปิดใช้งานในเซลล์ระยะบลาสโตซิสต์ เซลล์ของมวลเซลล์ชั้นในจะถูกเปลี่ยนเป็น ESC ที่มีศักยภาพในการแบ่งตัวได้หลายแบบ และเมื่อกลไกที่สองของการถ่ายทอดสัญญาณผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ (FGF2 - FGFR2 - MAP kinase ERK1/ERK2) ถูกเปิดใช้งาน เซลล์ต้นกำเนิดของโทรเฟกโตเดิร์มจะถูกสร้างขึ้นในระยะบลาสโตซิสต์ การเลือกเส้นทางการส่งสัญญาณนั้นขึ้นอยู่กับกิจกรรมของยีน oct4 ยีนนี้ซึ่งอยู่ในโดเมน POU ตั้งอยู่ที่ตำแหน่ง t ของออโตโซม 17 และถูกแสดงออกในระหว่างการสร้างไข่ ในช่วงระยะเวลาการแบ่งตัว รวมถึงในเซลล์ของมวลเซลล์ชั้นในของระยะบลาสโตซิสต์และในเซลล์สืบพันธุ์หลัก บทบาทการทำงานของยีน oct4 คือการเข้ารหัสปัจจัยการถอดรหัสซึ่งจำเป็นต่อการเกิดเซลล์ที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่าง การแบ่งตัวและการลดความแตกต่าง

การแสดงออกของยีน oct4 ใน ESC จะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับปฏิสัมพันธ์ระหว่างปัจจัยการถอดรหัสกับโคแฟกเตอร์ การควบคุมการแสดงออกของ oct4 ในระยะบลาสโตซิสต์โดยตรงแสดงให้เห็นว่าเมื่อกิจกรรมของยีนลดลง เซลล์ครึ่งหนึ่งจะก่อตัวเป็นโทรเฟกโตเดิร์ม ในขณะที่เมื่อการแสดงออกของ oct4 ที่ถูกเหนี่ยวนำเพิ่มขึ้น ESC จะเกิดขึ้นเป็นหลัก

ในการทดลองนี้ ESC ไม่สามารถถ่ายโอนไปยังสายพันธุ์ได้ในระหว่างการเพาะเลี้ยง blastomere ที่มีศักยภาพในระยะแตกเซลล์ รวมถึงในระยะการสร้างตัวอ่อนและระยะต่อมาของการพัฒนาตัวอ่อน ESC ของหนูมักจะถูกแยกออกในวันที่ 3.5-4.5 ของการตั้งครรภ์ ซึ่งตรงกับระยะที่ 6 (blastocyst ชั้นเดียว) และระยะที่ 7 (blastocyst สองชั้น - กระบอกไข่ในระยะแรก) ของการสร้างตัวอ่อนตามปกติ เห็นได้ชัดว่าเฉพาะในช่วงก่อนการฝังตัวเท่านั้นที่เอ็มบริโอของหนูจะมีประชากรเซลล์ที่สามารถเปลี่ยนเป็น ESC ได้ ดังนั้น การแยกสายพันธุ์ ESC จึงทำได้เฉพาะในระยะบางระยะของการสร้างตัวอ่อนเท่านั้น ไซโกตและ blastomere ที่เกิดขึ้นระหว่างการแยกตัวเป็น totipotent จากมุมมองของความเป็นไปได้ในการพัฒนาตัวอ่อนที่มีชีวิตที่มีเยื่อหุ้มตัวอ่อนและรก การสูญเสียศักยภาพทั้งหมดของเซลล์สืบพันธุ์จะเริ่มขึ้นที่ระยะโมรูลาตอนปลาย เมื่อระยะบลาสโตเมียร์จะเข้าสู่ระยะต่อไปโดยขึ้นอยู่กับตำแหน่งของเซลล์ บลาสโตเมียร์โมรูลาในระยะแรกจะยังคงมีศักยภาพในการเจริญเติบโตได้ เนื่องจากการปรับเปลี่ยนตำแหน่งในการทดลอง เช่น การกลับตำแหน่งของเซลล์ ไม่สามารถป้องกันการพัฒนาของตัวอ่อนที่สมบูรณ์ได้

ได้มีการพิสูจน์แล้วว่าประสิทธิภาพของการแยกเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน (ESC) ออกเป็นสายพันธุ์ได้รับผลกระทบจากสภาพของบลาสโตซิสต์ในช่วงเวลาของการปลูกถ่าย การใช้บลาสโตซิสต์หลังจากจำลองช่วงเวลาหยุดนิ่ง 7 วันในระบบสืบพันธุ์ของหนูที่ถูกตัดรังไข่ออกในวันที่ 3.5 ของการตั้งครรภ์และได้รับโปรเจสเตอโรนจะช่วยให้แยกสายพันธุ์เซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อนได้สำเร็จมากขึ้น สันนิษฐานว่าภายใต้เงื่อนไขดังกล่าว จำนวนบลาสโตเมียร์ที่สร้างมวลเซลล์ภายในจะเพิ่มขึ้น นอกจากนี้ ยังเป็นไปได้ที่วงจรเซลล์จะยาวนานขึ้นและบลาสโตเมียร์ส่วนใหญ่จะเข้าสู่ระยะ G0

นอกจากนี้ การสร้างสายพันธุ์ ESC pluripotent ที่มีเสถียรภาพนั้นขึ้นอยู่กับจีโนไทป์ของเอ็มบริโอ โดยสามารถแยกสายพันธุ์ ESC ออกจากระยะบลาสโตซิสต์ของสายพันธุ์หนู 129 ได้ค่อนข้างง่าย แต่การได้มาโดยใช้เมาส์ CS7BL/6 นั้นยากกว่ามาก และแทบจะเป็นไปไม่ได้เลยที่จะแยกสายพันธุ์ ESC ออกจากระยะบลาสโตซิสต์ของเมาส์ CBA/Ca เห็นได้ชัดว่าเอ็มบริโอในระยะแรกมีลักษณะทางพันธุกรรมบางอย่างที่ส่งผลต่อการพัฒนาสายพันธุ์ ESC pluripotent อย่างไรก็ตาม เมื่อเพาะเลี้ยงเอพิบลาสต์ที่แยกออกมา รวมถึงการคัดเลือกเซลล์ที่แยกความแตกต่างอย่างเลือกเฟ้น สายพันธุ์ ESC จะถูกแยกออกจากเอ็มบริโอในระยะแรกของเมาส์ CBA/Ca

เทคนิคมาตรฐานที่ได้รับการพิสูจน์แล้วสำหรับการได้รับสาย ESC จากระยะบลาสโตซิสต์นั้นมีอยู่ในคู่มือห้องปฏิบัติการเกี่ยวกับเทคนิคการทดลองกับเอ็มบริโอระยะแรก สาย ESC ทดลองยังสามารถได้รับได้โดยการเพาะเลี้ยงเอพิบลาสต์ (เอ็กโตเดิร์มหลัก) ที่แยกออกมาจากเอ็มบริโอของหนูอายุ 4.5 วันโดยใช้เทคนิคการผ่าตัดด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่ค่อนข้างซับซ้อนและสภาวะการเพาะเลี้ยงที่ดัดแปลง ความเข้มข้นของแรงงานของขั้นตอนนี้มีความสมเหตุสมผล เนื่องจากความถี่ของการสร้างสาย ESC ในกรณีนี้สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับการทำงานกับมวลเซลล์ภายในของระยะบลาสโตซิสต์

ในการแยกเซลล์ ESC แต่ละโคลนจะถูกถ่ายโอนไปยังไมโครเวลล์ จากนั้นจะเพาะเซลล์จำนวน 40-60 เซลล์ จากนั้นจึงกระจายอีกครั้ง การทำซ้ำขั้นตอนนี้ซ้ำหลายครั้งทำให้เราได้เซลล์ ESC ที่เป็นอมตะซึ่งมีอัตราการแพร่พันธุ์สูงสุดของเซลล์ปกติที่ติดอยู่กับพลาสติก ซึ่งยังคงความสามารถในการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดและการทำงานของเทโลเมอเรสสูงหลังจากผ่านไป 50-100 ครั้ง ในกระบวนการรักษาเซลล์ ESC อันตรายที่ยิ่งใหญ่ที่สุดคือการปนเปื้อนของเอนโดทอกซินของแบคทีเรียในอาหารเลี้ยงเชื้อหรือซีรั่ม แม้แต่เอนโดทอกซินที่มีความเข้มข้นเพียงเล็กน้อยในอาหารเลี้ยงเชื้อก็ทำให้เซลล์เชื้อที่ยังไม่โตเต็มที่ตายเป็นจำนวนมาก ด้วยการติดตามการเจริญเติบโตเชิงเส้นและการกระจายตัวในเวลาที่เหมาะสมอย่างระมัดระวัง ESC ในอาหารเลี้ยงเชื้อจึงสามารถแบ่งตัวแบบสมมาตรได้ โดยเซลล์ลูกทั้งสองจะยังคงมีความสามารถในการแบ่งตัวแบบหลายเซลล์และสามารถดำเนินวงจรเซลล์ได้ไม่จำกัดจำนวน โดยรักษาแคริโอไทป์แบบดิพลอยด์และศักยภาพทั้งหมดไว้

การคัดเลือกประชากร ESC ของมนุษย์ที่บริสุทธิ์สามารถทำได้หลังจากการถ่ายโอนยีนจีโนมของ ESC ด้วยโมเลกุล DNA รีคอมบิแนนท์ที่มียีนที่เข้ารหัสการสังเคราะห์โปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) การแสดงออกของ GFP จะเพิ่มขึ้นเมื่อ ESC เติบโตภายใต้เงื่อนไขที่สนับสนุนการแพร่พันธุ์ของพวกมัน ในขณะที่เมื่อเริ่มมีการแยกตัว ระดับการแสดงออกของยีนนี้จะลดลง ซึ่งทำให้สามารถเลือกสายเซลล์ที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงได้บริสุทธิ์บนอาหารเลี้ยงเชื้อแบบเลือกได้ เมื่อเพาะเลี้ยง ESC ที่แยกได้โดยใช้การคัดเลือก GFP ความถี่ของการสร้างโคโลนีจะเพิ่มขึ้นหลายเท่า เนื่องจากผลต้านการแพร่พันธุ์อันทรงพลังของเซลล์ที่แยกตัวแล้วจะถูกกำจัดภายใต้เงื่อนไขของการเพาะเลี้ยงแบบเลือก

การแปลเซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อนมนุษย์เป็นสายพันธุ์จะดำเนินการโดยใช้วิธีการแยกเซลล์จากตัวอ่อนก่อนการฝังตัว (ในระยะ 80-120 เซลล์) ซึ่งยังคงอยู่หลังจากขั้นตอนการปฏิสนธิในหลอดแก้ว เพื่อจุดประสงค์นี้ ตัวอ่อน "ส่วนเกิน" ที่ได้มาโดยเทียมจะถูกกระจายทางกลในอาหารเลี้ยงเชื้อ Delbecco-Eagle หลังจากติดฉลากเซลล์ด้วยแอนติบอดีโมโนโคลนัลแบบเลือกสรรพร้อมฉลากเรืองแสงแล้ว เซลล์ของตัวอ่อนจะถูกแยกออก ตัวอ่อนของตัวอ่อนจะถูกกระจายไปยังเซลล์แต่ละเซลล์โดยใช้ส่วนผสมของ dispase-collagenase เซลล์ที่แยกตัวออกจะถูกปลูกในอาหารเลี้ยงเชื้อพิเศษ (อาหารเลี้ยงเชื้อ Delbecco's 80% + ซีรั่มลูกวัว 20% ในสภาวะที่มี IL-6 500 μg/ml, LIF และ SCF) บนโมโนเลเยอร์ของไฟโบรบลาสต์ของตัวอ่อนใน 3 ช่วงแรก ในกรณีนี้ การอยู่รอดและการแบ่งตัวของเซลล์ต้นกำเนิดและเซลล์ต้นกำเนิดจะคงอยู่เนื่องจากผลของ IL-6, LIF และ SCF ในอาหารเลี้ยงเชื้อดังกล่าว ESC จะเติบโตเป็นโคลนแขวนลอยของเซลล์ที่ยังไม่ได้จับตัวกัน ซึ่งจะต้องแยกตัวออกด้วยปิเปตอ่อนซ้ำๆ โคลนใหม่จะปรากฏขึ้นในวัฒนธรรมแขวนลอยในวันที่ 5-7 อัตราการเจริญเติบโตสูงสุดของ ESC ทำได้โดยการแยกโคลนซ้ำๆ ในระยะ 10-15 เซลล์ จากนั้นโคลนแต่ละโคลนจะถูกถ่ายโอนไปยังไมโครเวลล์และเติบโตจนได้เซลล์รวม 40-50 เซลล์ ขั้นตอนนี้ทำซ้ำหลายครั้งในแต่ละช่วง โดยเพิ่มปริมาตรของวัฒนธรรมให้มีความหนาแน่น 5-10 ล้านเซลล์ต่อจานเพาะเชื้อขนาด 6 ซม. ทอมสันใช้วิธีการดังกล่าวในการแยกเซลล์ ESC ของมนุษย์ที่เป็นอมตะจำนวน 10 โคลน ซึ่งหลังจากผ่านกระบวนการดังกล่าว 100 ครั้ง เซลล์ ESC ของมนุษย์ยังคงมีกิจกรรมเทโลเมอเรสสูง ความสามารถในการขยายพันธุ์อย่างรวดเร็ว ลักษณะของฟีโนไทป์ขั้นต่ำ และศักยภาพโดยรวมในความสามารถในการแยกความแตกต่างเป็นเซลล์เฉพาะทาง 350 สายที่ได้จากเอ็กโต- เมโส- และเอนโดเดิร์ม การแยกความแตกต่างของเซลล์ ESC ของมนุษย์เริ่มขึ้น (เมื่อมีการเปลี่ยนตัวกลาง การเติมซีรั่ม และการกำจัด LIF) โดยเซลล์จะเกาะติดกับพื้นผิว ซึ่งบ่งชี้ถึงการพัฒนาของโครงร่างเซลล์และการแสดงออกของตัวรับการยึดเกาะ ที่สำคัญ เซลล์ ESC ของมนุษย์ยังคงมีแคริโอไทป์ปกติด้วยการแพร่พันธุ์ที่ไม่จำกัด

วิธีที่สองในการแยกเซลล์สืบพันธุ์ของมนุษย์นั้นใช้เซลล์สืบพันธุ์หลัก การศึกษาในเชิงทดลองแสดงให้เห็นว่าเซลล์สืบพันธุ์สามารถสกัดได้จากรอยพับของอวัยวะสืบพันธุ์ของเอ็มบริโอหนูอายุ 12.5 วัน อย่างไรก็ตาม ในกรณีดังกล่าว ความถี่ในการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดนั้นต่ำกว่าการทดลองกับเอ็มบริโอก่อนหน้านี้มาก ในเวลาเดียวกัน เซลล์สืบพันธุ์หลักจากต่อมเพศของเอ็มบริโอหนูอายุครรภ์ 13.5 วันไม่สามารถเปลี่ยนเป็นเซลล์สืบพันธุ์ได้เลย

เซลล์ EG ของมนุษย์ที่เสถียรในระยะแรกได้รับมาจากโกโนไซต์หลักที่แยกจากต่อมเพศของเอ็มบริโออายุ 5-9 สัปดาห์ เซลล์ที่แยกได้นั้นได้รับการเพาะเลี้ยงบนพื้นผิวของไฟโบรบลาสต์เอ็มบริโอของหนูที่ไม่ทำงานแล้วในอาหารเลี้ยงเชื้อ DMEM ร่วมกับซีรั่มของทารกในครรภ์ที่เสริมด้วยเมอร์แคปโตเอธานอล ฟอร์สโคลิน และปัจจัยการเจริญเติบโตของมนุษย์แบบรีคอมบิแนนท์ (FGF และ LIF) หลังจากผ่านไป 7-12 วัน โคโลนีหลายเซลล์จะปรากฏขึ้นในวัฒนธรรม ซึ่งสอดคล้องกับเซลล์ EG ของมนุษย์โดยลักษณะทางสัณฐานวิทยาและเครื่องหมายโมเลกุล หลังจากการรวมกลุ่ม เซลล์เหล่านี้จะสร้างร่างกายของเอ็มบริออยด์ โดยมีการพัฒนาต่อไป ซึ่งเซลล์เฉพาะทางที่มีลักษณะเฉพาะของอนุพันธ์ของชั้นเชื้อโรคทั้งสามชั้นจะปรากฏขึ้น ในช่วงเวลา 10-20 รอบ เซลล์ EG ยังคงรักษาแคริโอไทป์ปกติและไม่สูญเสียความสามารถในการสร้างเซลล์ได้

นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นด้วยว่าการทำงานร่วมกันของ LIF ปัจจัยเหล็กที่ละลายน้ำได้และเยื่อหุ้มเซลล์ และ TGF-b จะเปลี่ยนโปรแกรมการพัฒนาของเซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิม แทนที่จะหยุดการแบ่งตัวแบบไมโทซิสและเริ่มแยกความแตกต่างไปสู่การสร้างไข่หรือสเปิร์ม เซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมยังคงแพร่พันธุ์ต่อไป หลังจากรอบการแบ่งตัวเพิ่มเติมหลายรอบ พวกมันจะคล้ายกับเซลล์เอพิบลาสต์ และเมื่อสูญเสียคุณสมบัติของเซลล์สืบพันธุ์เบื้องต้น พวกมันจะถูกเปลี่ยนเป็นเซลล์ต้นกำเนิด EG ของตัวอ่อนที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่าง

ดังนั้นในปี 1998 จึงได้มีการแยกสายพันธุ์เซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมจากเนื้อเยื่อการชันสูตรศพทารกในครรภ์ของมนุษย์เป็นครั้งแรก ในกระบวนการสร้างตัวอ่อนของมนุษย์ เซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมจะปรากฏในถุงไข่แดงในสัปดาห์ที่ 3 ของการพัฒนา และในสัปดาห์ที่ 4-5 เซลล์เหล่านี้จะอพยพไปยังโซนตุ่มเนื้อที่อวัยวะเพศ ซึ่งพวกมันจะสร้างกลุ่มเซลล์สืบพันธุ์หลักที่จำศีล ในสถานะที่ไม่ทำงาน เซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมจะถูกเก็บรักษาไว้ในตัวอ่อนจนกว่าจะคลอด สายพันธุ์เซลล์สืบพันธุ์ดั้งเดิมจะถูกแยกจากตุ่มเนื้อที่อวัยวะเพศของทารกในครรภ์ของตัวอ่อนอายุ 5-9 สัปดาห์ ซึ่งเนื้อเยื่อที่สกัดได้จะได้รับการรักษาโดยทันทีด้วยส่วนผสมของคอลลาจิเนสชนิด IV-V ไฮยาลูโรนิเดส และ DNase เพื่อเพิ่มปริมาณและคุณภาพของเซลล์ เซลล์เชื้อพันธุ์ดั้งเดิมในเนื้อเยื่อของตุ่มเนื้อของทารกในครรภ์ถูกล้อมรอบด้วยเซลล์เซอร์โทลิสโตรมา (มีเซนไคมอล) วัตถุประสงค์การทำงานของเซลล์เซอร์โทลิคือการผลิตปัจจัยต่อต้านอะพอพโทซิส (ลิแกนด์ Fas) ไมโตเจน และยากดภูมิคุ้มกันที่ปกป้องเซลล์เชื้อพันธุ์จากการโจมตีของภูมิคุ้มกันโดยร่างกาย นอกจากนี้ สภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้อเยื่อเกี่ยวพันของตุ่มเนื้อของทารกในครรภ์ยังมีบทบาทสำคัญในการทำให้เซลล์สืบพันธุ์เติบโต เซลล์เชื้อพันธุ์หลักที่แยกออกมาจะถูกปลูกในวัฒนธรรมเหนือชั้นเนื้อเยื่อเกี่ยวพันที่ประกอบด้วยไฟโบรบลาสต์ของทารกในครรภ์จากสามช่วงแรก การรวมกันของไมโตเจนที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดคือสารเชิงซ้อนที่ประกอบด้วย LIF, FGF และฟอร์สโคลิน (สารกระตุ้นการสร้าง cAMP) การเพิ่มจำนวนของเซลล์เชื้อพันธุ์หลักในหลอดทดลองต้องอาศัยการเติมซีรั่มของทารกในครรภ์ ซึ่งการเพาะเลี้ยงของโกโนไซต์หลักจะมาพร้อมกับการสร้างโคลนของเซลล์ทรงกลมที่ไม่ยึดติดกับสารตั้งต้น

ที่สถาบันสุขภาพแห่งชาติ สหรัฐอเมริกา จากข้อมูลสรุปที่มีอยู่เกี่ยวกับวิธีการแยกเซลล์ ESC ของมนุษย์จากระยะบลาสโตซิสต์ ได้ข้อสรุปเบื้องต้นว่าการแยกเซลล์ ESC สำเร็จนั้นมีแนวโน้มสูงสุดเมื่อเพาะเลี้ยงระยะบลาสโตซิสต์ที่มีมวลเซลล์ภายในที่ก่อตัวดี (เซลล์ต้นกำเนิด: ความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์และทิศทางการวิจัยในอนาคต สถาบันสุขภาพแห่งชาติ สหรัฐอเมริกา) จากมุมมองนี้ แหล่งเซลล์ ESC ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการสร้างเซลล์คือระยะบลาสโตซิสต์ของมนุษย์ในวันที่ 5 ของการพัฒนา ซึ่งควรนำโทรเฟกโตเดิร์มออกอย่างระมัดระวังเมื่อแยกมวลเซลล์ภายใน มวลเซลล์ภายในที่แยกได้ซึ่งประกอบด้วยเซลล์ 30-35 เซลล์ในระยะนี้ ควรเพาะเลี้ยงบนพื้นผิวของไฟโบรบลาสต์ของหนูเอ็มบริโอ ซึ่งเป็นเงื่อนไขสำคัญสำหรับการสร้างอาณานิคมเซลล์ ESC ในการเพาะเลี้ยง

การวิเคราะห์ลักษณะทางฟีโนไทป์ของเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน

สิ่งที่น่าสนใจเป็นพิเศษคือการวิเคราะห์เชิงเปรียบเทียบระหว่างสปีชีส์ของลักษณะทางฟีโนไทป์ของ ESC พบว่ากลุ่มเซลล์ ESC ของมนุษย์เป็นกลุ่มเซลล์ที่แบนราบคล้ายเยื่อบุผิว ในขณะที่กลุ่มเซลล์เอ็มบริออยด์ของหนูประกอบด้วยกลุ่มเซลล์ที่โค้งมนและหลวมๆ ใน ESC ของมนุษย์ ดัชนีอัตราส่วนนิวเคลียสต่อพลาสมาจะต่ำกว่าใน ESC ของหนู เซลล์ต้นกำเนิดของเอ็มบริโอของลิงสร้างกลุ่มเซลล์ที่แบนราบกว่าโดยมีขอบไม่เรียบ เซลล์แต่ละเซลล์สามารถมองเห็นได้ง่ายในโคลนแรกของ ESC ของไพรเมต ESC ที่ขยายพันธุ์ของสปีชีส์สัตว์ที่ศึกษาทั้งหมดไม่แสดงโมเลกุล MHC คลาส I และ II ในเวลาเดียวกัน ESC ของมนุษย์ให้ปฏิกิริยาเชิงบวกกับแอนติบอดี TERA 1-60 และ GCTM-2 ซึ่งบ่งชี้ถึงการมีอยู่ของโปรตีโอกลีแคนเคราติน/คอนโดรอิทินซัลเฟตบนพื้นผิว ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของเซลล์ต้นกำเนิดของเอ็มบริโอ-(เทอราโต)-คาร์ซิโนมา การแสดงออกของยีน oct4 ใน ESC ของสัตว์ทุกชนิดบ่งชี้ว่า แม้จะมีความแตกต่างกันของลักษณะทางกายภาพ แต่ชุดยีนเดียวกันที่ทำหน้าที่รักษาความสามารถในการเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมกลับถูกกระตุ้นใน ESC ของมนุษย์และหนู (Peru, 2001) นอกจากนี้ สายพันธุ์ ESC ที่แยกได้จากเอ็มบริโอของหนู หมู กระต่าย ลิง และวัวมีลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่คล้ายคลึงกัน มีเครื่องหมายระบุโมเลกุลชุดเดียวกัน และกลไกโมเลกุลที่เกือบจะเหมือนกันสำหรับการนำโปรแกรมการสร้างเอ็มบริโอมาใช้ ซึ่งทำให้เราสามารถมองปัญหาของการปลูกถ่ายข้ามสายพันธุ์ได้ใหม่

ไม่เหมือนการสร้างตัวอ่อนตามปกติในร่างกาย การแบ่งตัวของ ESC ในหลอดทดลองจะไม่เกิดขึ้นพร้อมกับการสร้างชั้นเชื้อโรค แต่เกิดขึ้นโดยมี Hoxgenes โฮมีโอติกเป็นตัวปิดกั้น กล่าวคือ ไม่มีการสร้างอวัยวะ เนื่องจากยีนการแบ่งส่วนไม่ทำงาน จึงไม่สามารถจำลองช่วงเวลาการสร้างตัวอ่อน เช่น การวางไข่ การแบ่งส่วนของตัวอ่อน การสร้างถุงไข่แดง อัลลันทัวส์ และอวัยวะและเนื้อเยื่อชั่วคราวอื่นๆ ในวัฒนธรรม ESC ได้ ESC ที่เพาะเลี้ยงดูเหมือนจะหยุดนิ่งในช่วงเริ่มต้นของกระบวนการสร้างเซลล์จำกัดจำนวน 350 สายของเซลล์เฉพาะทาง ดังนั้น โคลนของเซลล์ต้นกำเนิดลูกและ ESC ที่อยู่ในตำแหน่งศูนย์กลางจึงเป็นเพียงแบบจำลองของตัวอ่อน ซึ่งในระหว่างการพัฒนา เซลล์เฉพาะทางต่างๆ จะก่อตัวขึ้นพร้อมกันในบริเวณเนื้อเยื่อต่างๆ ซึ่งอย่างไรก็ตาม เซลล์เหล่านี้มีต้นกำเนิดมาจากเซลล์ตั้งต้นทั่วไป แม้ว่าตัวรับบนพื้นผิวของ ESC จะมีระดับต่ำ แต่ก็ยังคงสามารถดำเนินกระบวนการสร้างรูปร่างแบบดั้งเดิมได้ โดยเลียนแบบโครงสร้างเชิงปริมาตรของตัวอ่อนในระยะแรก: ESC ที่แขวนลอยอยู่ในวัฒนธรรมจะรวมตัวกันและสร้างโครงสร้างที่คล้ายกับระยะบลาสโตซิสต์หรือแม้แต่ตัวอ่อนในระยะหลัง (กระบอกไข่) การรวมตัวที่แขวนลอยดังกล่าวเรียกว่าเอ็มบริออยด์บอดีแบบง่ายหรือแบบซับซ้อนตามลำดับ

ในการแยกส่วนแบบผสม ยีนเริ่มต้นของเอ็กโทเดิร์ม (oct3, fgf-5, nodal), เอ็นโดเดิร์ม (gata-4), เมโซเดิร์ม (brachyury), เมโซเดิร์มที่สร้างหัวใจ (pkh-2.5), ท่อประสาท (msx3) และการสร้างเม็ดเลือด (elkf) จะถูกแสดงออกพร้อมกันในเซลล์ต่างๆ ของเอ็มบริออยด์บอดีหนึ่งเซลล์ การใช้ปัจจัยการเจริญเติบโตและไซโตไคน์ร่วมกันหลายแบบเพื่อการกระทำที่กำหนดเป้าหมายในการสร้างเซลล์ชั้นเชื้อโรคในหลอดทดลอง ทำให้ในหลายกรณีสามารถได้เอ็มบริออยด์บอดีที่ยีนของเอ็กโทเดิร์มหรือเมโซเดิร์มถูกแสดงออกโดยเฉพาะ ซึ่งเปิดทางไปสู่การสร้างแบบจำลองการสร้างแกสตรูเลชันและระยะเริ่มต้นของการสร้างอวัยวะ

การเจริญเติบโตของโคลนของ ESC เป็นหลักฐานของการแบ่งเซลล์แบบไม่สมมาตร ซึ่งมีเพียง ESC หนึ่งตัวในใจกลางโคลนที่ยังคงมีศักยภาพในการแบ่งตัวแบบไม่จำกัด ในขณะที่เซลล์ลูกที่สองสร้างเซลล์ต้นกำเนิดรุ่นหนึ่งที่กำลังอยู่ในระหว่างการแบ่งตัว ดังนั้น อัตราการแบ่งตัวของโคลนที่บริเวณรอบนอกของเอ็มบริออยด์บอดีจึงสูงกว่าบริเวณกลาง เซลล์ขอบของโคลนที่กำลังเติบโตจะเกิดการแบ่งตัวแบบผิดปกติ อพยพ หรือตายโดยกลไกอะพอพโทซิส เหตุการณ์เหล่านี้กำหนดชะตากรรมของโคลน หากอัตราการแบ่งตัวเกินอัตราการอพยพและการตายของเซลล์จากอะพอพโทซิส โคลนจะยังคงเพิ่มขนาดต่อไป การคงตัวจะเกิดขึ้นเมื่ออัตราอะพอพโทซิสและอัตราการสร้างเซลล์ใหม่เท่ากัน และการถดถอยจะเกิดขึ้นเมื่ออัตราส่วนของกระบวนการเหล่านี้ผกผัน เซลล์ต้นกำเนิดแบ่งตัวแบบสมมาตร กล่าวคือ เซลล์ลูกทั้งสองจะแยกตัวเป็นสายเซลล์เฉพาะที่โตเต็มที่ในเวลาต่อมา อัตราส่วนของ ESC ต่อเซลล์ต้นกำเนิดนั้นแตกต่างกัน แต่จำนวน ESC นั้นมักจะเป็นเพียงเศษเสี้ยวของเปอร์เซ็นต์ของประชากรเซลล์ต้นกำเนิดเท่านั้น ดังนั้น การเพิ่มจำนวน ESC ในวัฒนธรรมจึงทำได้ด้วยปิเปตอย่างระมัดระวังและการแยกโคลนอย่างทันท่วงทีเท่านั้น การแยกโคลนในระยะ 10-12 เซลล์นั้นได้ผลดีที่สุดในการให้ผลผลิต ESC สูงสุด ทิศทางและระดับการแบ่งตัวของเซลล์ในเอ็มบริออยด์บอดีนั้นขึ้นอยู่กับตำแหน่งของเซลล์ เซลล์ด้านนอกของเอ็มบริออยด์บอดีจะไม่แสดงออกถึงยีน oct4 และจะแยกตัวเป็นเซลล์ของเอ็นโดเดิร์มหลัก จากนั้นเซลล์ที่คล้ายเยื่อบุผิวของเอ็นโดเดิร์มนอกเอ็มบริออยด์บริเวณพาริเอทัลและบริเวณอวัยวะภายในจะถูกสร้างขึ้นในภายหลัง เซลล์ด้านในของเอ็มบริออยด์บอดีจะแสดงถึงยีน oct4 และคงความสามารถในการแบ่งตัวไว้เป็นเวลา 48 ชั่วโมงของการเพาะเลี้ยง อย่างไรก็ตาม วัฒนธรรมจะปรับโครงสร้างใหม่ทางสัณฐานวิทยาเป็นชั้นเยื่อบุผิวและเริ่มการแสดงออกของยีนที่ควบคุมการพัฒนาของเอ็กโทเดิร์มหลัก จากนั้นกระบวนการของการแบ่งตัวของเซลล์ที่ผิดปกติทั้งหมดจะเริ่มต้นด้วยการปรากฏของเซลล์ประเภทต่างๆ ที่เป็นอนุพันธ์ของชั้นเชื้อโรคทั้งสามชั้น ในกระบวนการแบ่งตัวของเซลล์ของเอ็มบริออยด์โดยธรรมชาติ การรวมตัวกับเครื่องหมายเอนโดเดิร์มในรูปแบบของชิ้นส่วน (ซีสต์) ของถุงไข่แดงจะเป็นสิ่งแรกที่ปรากฏขึ้น จากนั้น แองจิโอบลาสต์และเซลล์บุผนังหลอดเลือดของหลอดเลือดฝอยที่กำลังเติบโตจะปรากฏในโครงสร้างเหล่านี้ ในระยะสุดท้ายของการแบ่งตัวโดยธรรมชาติ เซลล์ที่แบ่งตัวในระยะสุดท้ายต่างๆ จะพัฒนาจากเซลล์ภายในของเอ็มบริออยด์บอดี รวมถึงเซลล์ประสาท เซลล์เกลีย เซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ เซลล์แมคโครฟาจ และเซลล์เม็ดเลือดแดง ในระดับหนึ่ง (โดยคำนึงถึงการกลับด้านเชิงพื้นที่ของการก่อตัวของชั้นเนื้อเยื่อเจริญ) โดยใช้ร่างกายของเอ็มบริออยด์ ทำให้สามารถศึกษากระบวนการสร้างรูปร่างในหลอดทดลองและวิเคราะห์กลไกระดับโมเลกุลของช่วงเริ่มต้นของการแยกเซลล์ของเอ็มบริโอได้รวมถึงการกำหนดบทบาทของยีนเฉพาะในการดำเนินกระบวนการเหล่านี้

ดังนั้นภายในโคลนจะมีเซลล์ที่ค้นพบโปรแกรมการพัฒนาทางพันธุกรรมที่แตกต่างกัน ได้แก่ ESC เซลล์ต้นกำเนิดระยะแรก และเซลล์ต้นกำเนิดที่แยกความแตกต่าง การเพาะเลี้ยง ESC ด้วยวิธีแขวนหรือเพาะเลี้ยงแบบกลุ่มโดยไม่มีชั้นป้อนอาหารและไม่เติม LIF ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ นำไปสู่การสร้างเอ็มบริออยด์บอดีอย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้ สัณฐานวิทยาของเซลล์ในชั้นนอกและชั้นในของเอ็มบริออยด์บอดีนั้นแตกต่างกัน ชั้นนอกประกอบด้วยเซลล์ที่มีกิ่งก้านขนาดใหญ่ พื้นผิวที่หันเข้าหาสิ่งแวดล้อมถูกปกคลุมด้วยไมโครวิลลีจำนวนมาก ชั้นนอกของเซลล์แยกจากชั้นในด้วยเยื่อฐานที่คล้ายกับเยื่อของไรเคิร์ต ในขณะที่เซลล์ในชั้นในของเอ็มบริออยด์บอดีเป็นเยื่อบุผิวแบบคอลัมนาร์ ทางสัณฐานวิทยา ชั้นในแม้ว่าจะมีเซลล์ที่แบ่งตัวจำนวนมาก แต่ก็มีลักษณะคล้ายคลึงกับกลุ่มเซลล์ ESC ที่ยังไม่แยกความแตกต่างมากกว่า

ลักษณะเฉพาะของเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนของมนุษย์

การไม่มีปฏิสัมพันธ์ระหว่างการส่งสัญญาณของเนื้อเยื่อและเนื้อเยื่อเกี่ยวพันกับพื้นหลังของการบล็อกยีนโฮมีโอซิสทำให้เซลล์ ESC ในวัฒนธรรมเติบโตผิดปกติ เนื่องจากสิ่งนี้จะขัดขวางการสร้างและการพัฒนาโครงสร้างพื้นฐานของอวัยวะชั่วคราว การเติบโตผิดปกติและการแบ่งตัวตามธรรมชาติที่ผิดปกติของเซลล์ ESC ในวัฒนธรรมเกิดจากการไม่มีเครื่องหมายเนื้อเยื่อเกี่ยวพันของกรอบโครงสร้างของอวัยวะในอนาคต ในหลอดทดลอง เป็นไปได้ค่อนข้างมากที่จะสร้างเซลล์ตับได้หลายล้านเซลล์ แต่เป็นไปไม่ได้ที่จะได้ตับเพียงตับเดียวที่มีองค์ประกอบเชิงโครงสร้างและฟังก์ชัน เช่น ไซนัส ช่อง Disse และเซลล์ Kupffer

เชื่อกันว่าความสามารถในการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน (ESC) เกิดขึ้นได้เฉพาะในกระบวนการสร้างตัวอ่อนเท่านั้น โดยเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนจะก่อตัวขึ้นจากเนื้อเยื่อและอวัยวะของตัวอ่อน ในขณะที่รกและสายสะดือเป็นอนุพันธ์ของ trophoblast เซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนที่อยู่ในเยื่อหุ้ม trophectodermal จะสร้างโคลนของเซลล์ชั่วคราวตามลำดับ ซึ่งจะดำเนินการตามโปรแกรมการพัฒนาผ่าน mRNA แบบผสมผสานของเมทริกซ์โทโพกราฟีเชิงปริมาตรของ Nokhteyov ซึ่งกำหนดตำแหน่ง รูปร่าง และขนาดในเชิงพื้นที่ จำนวนเซลล์ของอวัยวะชั่วคราวและอวัยวะสุดท้าย ตลอดจนการประกอบเนื้อเยื่อเป็นหน่วยโครงสร้างและหน้าที่ ในเวลาเดียวกัน เซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนยังคงเป็นเซลล์ประเภทเดียวที่กลไกโมเลกุลสำหรับการดำเนินการตามศักยภาพนั้นแยกออกจากโปรแกรมการพัฒนาทางพันธุกรรมโดยสิ้นเชิง และเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนเองก็ขาดความสามารถในการโต้ตอบกับเซลล์อื่นเนื่องจากการปิดกั้นทั้งระบบการรับรู้ของตัวรับและระบบทรานส์ซิกแนลลิ่ง อย่างไรก็ตาม การเปิดใช้งาน ESC อย่างเหมาะสมจะนำไปสู่การพัฒนาโปรแกรมการสร้างตัวอ่อนทีละขั้นตอน ซึ่งสิ้นสุดลงด้วยการเกิดสิ่งมีชีวิตที่มีรูปร่างสมบูรณ์ซึ่งประกอบด้วยเซลล์หลายพันล้านเซลล์ที่พร้อมสำหรับชีวิตนอกมดลูก ในเส้นทางระยะสั้นแต่ยาวนานอย่างไม่อาจจินตนาการได้ในพื้นที่เซลล์นี้ ข้อผิดพลาดเกิดขึ้นอย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้ทั้งในกลไกระดับโมเลกุลที่รับรองกิจกรรมที่สำคัญของเซลล์และในโปรแกรมที่ควบคุมการแพร่กระจาย การแยกความแตกต่าง และการสร้างความจำเพาะ ดังนั้น ในเภสัชพันธุศาสตร์สมัยใหม่ โรคของโครงสร้างโมเลกุลและโรคของการเขียนโปรแกรมเซลล์จึงได้รับการพิจารณาแยกกัน ยิ่งไปกว่านั้น การทำงานของยาใหม่ส่วนใหญ่มุ่งเป้าไปที่การแก้ไขโปรแกรมการแยกความแตกต่าง การแบ่งแยก และการสร้างอวัยวะ รวมถึงการสร้างอวัยวะและเนื้อเยื่อใหม่ ในสิ่งมีชีวิตที่โตเต็มวัย ESC ช่วยให้สามารถควบคุมพฤติกรรมของเซลล์ต้นกำเนิด/เซลล์ต้นกำเนิดที่ปลูกถ่ายเข้าไปในสมอง ตับ ม้าม ไขกระดูก และอวัยวะอื่นๆ ของมนุษย์ เพื่อฟื้นฟูเนื้อเยื่อของอวัยวะที่เสียหาย โดยการแยกความแตกต่างและการทำให้เซลล์ผู้บริจาคมีความเฉพาะเจาะจงบนเมทริกซ์เนื้อเยื่อเกี่ยวพันที่เก็บรักษาไว้ โดยพื้นฐานแล้ว โปรแกรมความสามารถในการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดเริ่มเกิดขึ้นจริงในระดับจีโนมของไข่ ไซโกต และบลาสโทเมียร์ อย่างไรก็ตาม เซลล์เหล่านี้ยังไม่ได้รับการโคลนและผ่านเข้าไปในปริมาณที่จำเป็นสำหรับความต้องการของการแพทย์เชิงทดลองและเชิงปฏิบัติ ดังนั้น ESC จึงยังคงเป็นแหล่งข้อมูลทางพันธุกรรมเฉพาะที่มีรหัสสำหรับแผนที่สามมิติของตัวอ่อนและรหัสสำหรับการจำกัดเซลล์เฉพาะทางแบบเส้นตรงระหว่างการสร้างตัวอ่อน

ศักยภาพในการสร้างใหม่ของเซลล์ต้นกำเนิดเซลล์... การใช้การวิเคราะห์ลำดับการแสดงออกของยีนแสดงให้เห็นว่าด้วยการทำงานร่วมกันของกล่องฟังก์ชันหลักของจีโนมที่ควบคุมพลังงานและการเผาผลาญในเซลล์โซมาติกและ ESC เซลล์โซมาติกมีระดับ mRNA ของตัวรับ โปรตีน G ผู้ส่งสารรอง ทรานสคริปเทส โคแฟกเตอร์การแสดงออกและการยับยั้งต่ำมาก กล่าวคือ ระบบทั้งหมดของการส่งสัญญาณควบคุมไปยังเซลล์ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ ซึ่งเกิดจากการไม่มีหรือมีการแสดงออกของยีนทรานส์ซิกแนลลิ่งต่ำมาก ในช่วงเวลาของการแยกความแตกต่างที่เหนี่ยวนำในจีโนม ESC ยีนที่ทำงานอยู่ 18 ยีนจะหยุดทำงานพร้อมกันโดยมีการกระตุ้นยีนทรานส์ซิกแนลลิ่ง 61 ยีนที่ควบคุมการสังเคราะห์ตัวรับการยึดเกาะเซลล์ ส่วนประกอบของเมทริกซ์นอกเซลล์ ทรานสคริปเทสจำกัด และองค์ประกอบผู้ส่งสารของระบบส่งสัญญาณไปยังอุปกรณ์นิวเคลียร์จากตัวรับของเยื่อหุ้มเซลล์พลาสมา ในเวลาเดียวกัน การแสดงออกของยีนที่รับผิดชอบในการสังเคราะห์โปรตีนตัวปิดเสียงก็ถูกบล็อก รวมไปถึงสารยับยั้งการแสดงออกของยีนร่วมที่รับรองความสามารถในการทำงานของจีโนม ESC

พบว่ามีเครื่องหมายยีนสำหรับเซลล์ของทั้งสามชั้นเชื้อโรค การระบุชั้นเซลล์เอ็กโทเดิร์มทำได้โดยการแสดงออกของยีน nodal, oct3 และ fgf-5 เซลล์ mesoderm ทำได้โดยการแสดงออกของยีน brachyury, ยีน zeta-globin และเซลล์ endoderm ทำได้โดยการแสดงออกของยีน gata-4 ในกระบวนการสร้างตัวอ่อนตามปกติในช่วงระยะการสร้างตัวอ่อน จะสังเกตเห็นการอพยพของเซลล์ต้นกำเนิดและเซลล์ต้นกำเนิดที่ยังไม่โตเต็มที่ โดยทำเครื่องหมายบริเวณการพัฒนาของกระดูกใบหน้าของกะโหลกศีรษะ บางส่วนของสมอง ระบบประสาทส่วนปลาย ระบบการนำไฟฟ้าของหัวใจ และต่อมไทมัส ซึ่งเนื้อเยื่อเหล่านี้ก่อตัวขึ้นจากโคลนของเซลล์ที่อพยพ การทำเครื่องหมายเซลล์ด้วยยีนเริ่มต้นของชั้นเชื้อโรคช่วยให้การวิเคราะห์ภูมิประเทศของกระบวนการอพยพของเซลล์ต้นกำเนิดในตัวอ่อนที่กำลังพัฒนาทำได้ง่ายขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ได้มีการพิสูจน์แล้วว่าในเซลล์มะเร็งเอ็มบริโอคาร์ซิโนมา P19 ที่มีการรวมกลุ่มกัน การแสดงออกของยีน brachyury แรกของ mesoderm เริ่มต้นในช่วงที่การแสดงออกของยีนของตัวกระตุ้นพลาสมินเจนของเนื้อเยื่อลดลง ได้แก่ α-fetoprotein, keratin 8 และ keratin 19 ซึ่งเป็นเครื่องหมายของประชากร mesoderm ที่อพยพครั้งแรก ดังนั้น การก่อตัวของเนื้อเยื่อที่มีต้นกำเนิดจาก mesoderm จึงเริ่มต้นขึ้นหลังจากกระบวนการอพยพแบบจุดและการแพร่กระจายของเซลล์ต้นกำเนิด mesoderm เสร็จสิ้นลงเท่านั้น

แม้ว่าลักษณะทางฟีโนไทป์จะจำกัดอย่างมากและไม่มีหน่วยส่งสัญญาณทรานส์ส่วนใหญ่ ESC ยังคงแสดงโมเลกุลตัวรับบางส่วนที่สามารถใช้เพื่อระบุตัวตนได้ ที่น่าสังเกตคือแอนติเจนมาร์กเกอร์ ESC ในมนุษย์และไพรเมตนั้นพบได้ทั่วไป โดยส่วนใหญ่มักใช้แอนติบอดีที่ติดฉลากกับแอนติเจนที่ผูกกับเยื่อหุ้มเซลล์ SSEA-3, SSEA-4 (แอนติเจนลิพิดเฉพาะที่แสดงถึงสารประกอบของไกลโคลิปิด GL7 กับกรดไซอาลิก) รวมถึงไกลโคโปรตีนโพลีเมอร์สูง TRA-1-81, TRA-1-60 สำหรับการติดฉลาก ESC นอกจากนี้ ESC ยังแสดงแอนติเจนของเอ็มบริโอที่เฉพาะเจาะจง SSEA-1 และฟอสฟาเตสอัลคาไลน์ภายในเซลล์ รวมถึงปัจจัยการถอดรหัสเฉพาะ Oct4 ซึ่งปัจจัยหลังมีความจำเป็นในการรักษากลไกการแพร่กระจายของ ESC โดยปัจจัยการถอดรหัสเฉพาะ Oct4 จะกระตุ้นการแสดงออกของยีนปัจจัยการเจริญเติบโตของไฟโบรบลาสต์ 4 และทำให้การแสดงออกของกล่องยีนที่รับผิดชอบการจำลองดีเอ็นเอไม่จำกัดในเซลล์ที่ยังไม่โตเต็มที่มีความเสถียร โปรตีนมาร์กเกอร์ภายในเซลล์ที่สำคัญที่สุดคือ Oct3, Oct4, Tcf และ Groucho ซึ่งเกี่ยวข้องกับโปรตีนตัวเก็บเสียงโครมาติน

เกือบจะทันทีหลังจากหลายปีของความพยายามในการเพาะเลี้ยง ESC นอกร่างกายประสบความสำเร็จ และได้เพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดชุดแรกจากบลาสโตซิสต์ของหนูและเพาะเลี้ยงเซลล์สืบพันธุ์หลัก ขั้นตอนการวิจัยเกี่ยวกับศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมของ ESC จึงเริ่มขึ้นเมื่อนำเข้าไปในตัวอ่อนในระยะเริ่มต้นของการพัฒนา ผลปรากฏว่าในระยะมอรูลาและบลาสโตซิสต์ ESC สามารถสร้างตัวอ่อนไคเมอริกได้ โดยลูกหลานของ ESC ที่บริจาคจะถูกตรวจพบในเนื้อเยื่อร่างกายทั้งหมดและแม้แต่ในเซลล์สืบพันธุ์ ดังนั้น ในทางชีววิทยาการพัฒนา การใช้ ESC จึงได้สร้าง "สะพาน" ระหว่างการศึกษาทดลองในร่างกายและในหลอดทดลอง ซึ่งขยายความเป็นไปได้ในการศึกษาขั้นตอนการสร้างเนื้อเยื่อและอวัยวะหลัก การแยกความแตกต่าง และการสร้างอวัยวะของตัวอ่อนอย่างมีนัยสำคัญ

เป็นที่ชัดเจนว่าในระหว่างกระบวนการสร้างตัวอ่อน ESC จะถูกรวมเข้ากับมวลเซลล์ของตัวอ่อนในระยะแรก และอนุพันธ์ของ ESC จะพบได้ในอวัยวะและเนื้อเยื่อทั้งหมด ESC จะเข้าไปตั้งรกรากในเซลล์สืบพันธุ์ในตัวอ่อนไคเมอริก ซึ่งลูกหลานจะก่อตัวเป็นไข่และอสุจิที่สมบูรณ์ เซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อนเป็นเซลล์โคลนนิ่ง โดยเซลล์ ESC เพียงตัวเดียวสามารถสร้างกลุ่มเซลล์ที่มีเครื่องหมายโมเลกุลที่เหมือนกันทางพันธุกรรมได้ ซึ่งรวมถึงการแสดงออกของยีน oct4 และฟอสฟาเตสอัลคาไลน์ กิจกรรมเทโลเมอเรสสูง และการแสดงออกของแอนติเจนของตัวอ่อนบางชนิด

เพื่อศึกษาเกี่ยวกับกลไกของการสร้างตัวอ่อนโดยใช้ ESC ได้มีการพัฒนาวิธีการสร้างไคเมอไรเซชันของโมรูลาโดยการสร้างโครงสร้างทางชีววิทยา ซึ่งภายนอกจะมีชั้นของบลาสโตเมียร์เททราพลอยด์ของผู้รับ และ ESC ของผู้ให้จะถูกนำเข้าไปข้างใน ดังนั้น ทรอโฟบลาสต์จึงถูกสร้างขึ้นจากลูกหลานของบลาสโตเมียร์เททราพลอยด์ของผู้รับ ซึ่งช่วยให้เกิดการฝังตัวและการสร้างรก และ ESC ของผู้ให้ทำหน้าที่เป็นมวลเซลล์ภายในที่ร่างกายของตัวอ่อนที่มีชีวิตและสายเซลล์เชื้อพันธุ์ต้นกำเนิดหลักถูกสร้างขึ้น คุณค่าของ ESC ในการวิจัยไม่ได้อยู่ที่ความสามารถในการสร้างตัวอ่อนได้หลายสายพันธุ์ได้รับการรักษาไว้ระหว่างการปรับเปลี่ยนในหลอดทดลองกับจีโนมของตัวอ่อนเท่านั้น แต่ยังรวมถึงความสามารถในการสร้างเซลล์เชื้อพันธุ์หลักของตัวอ่อนไคเมอริกของ ESC อีกด้วย มีการแสดงให้เห็นว่าลูกหลานของ ESC ที่ถูกดัดแปลงพันธุกรรมเพียงตัวเดียวจะเข้าไปอยู่ในเนื้อเยื่อพื้นฐานและเนื้อเยื่อที่กำลังพัฒนาทั้งหมดของเอ็มบริโอไคเมอริกที่ได้จากการรวมกลุ่มหรือการเพาะเลี้ยงร่วมกันของเซลล์นี้กับเอ็มบริโอ 8 เซลล์ เมื่อย้าย ESC ที่มียีนโปรตีนเรืองแสงสีเขียวเข้าไปในมอรูลาของหนู ลูกหลานของเซลล์เรืองแสงนี้จะพบในเนื้อเยื่อที่ศึกษาของเอ็มบริโอที่กำลังพัฒนาทั้งหมด (Shimada, 1999) การย้าย ESC เข้าไปในมอรูลาทำให้สามารถสร้างหนูที่มีชีวิตได้ ซึ่งสิ่งมีชีวิตประกอบด้วยลูกหลานของ ESC ผู้บริจาคเท่านั้น ซึ่งเปิดโอกาสให้มีทางเลือกต่างๆ สำหรับการโคลนนิ่งเพื่อการรักษา ปัจจุบัน แนวทางเชิงวิธีการนี้ใช้ได้ผลในการศึกษาปัญหาของชีววิทยาการพัฒนา โดยเฉพาะอย่างยิ่งใช้ในการวิเคราะห์กลไกของการปิดใช้งานทางพันธุกรรมของโครโมโซม X หรือความไม่เสถียรทางเอพิเจเนติกของ ESC การปลูกถ่าย ESC เข้าไปในตัวอ่อนระยะแรกยังใช้ในเทคโนโลยีชีวภาพทางการเกษตร รวมถึงการทดลองยีนบำบัดด้วย

การปลูกถ่าย ESC ที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรมนั้นใช้เพื่อทดสอบเซลล์เป้าหมายของยีนกลายพันธุ์ ESC ที่เพาะเลี้ยงในหลอดทดลองนั้นใช้ในเทคโนโลยีชีวภาพเพื่อสร้างหนูที่ถูกน็อกเอาต์ เพื่อจุดประสงค์นี้ ยีนที่จะศึกษาจะถูกลบออกจาก ESC โดยการสร้างยีนที่เหมือนกัน (น็อกเอาต์) และเซลล์ที่ไม่มียีนนี้จะถูกแยกออกในอาหารเลี้ยงเชื้อแบบเลือก จากนั้น ESC ที่ถูกน็อกเอาต์จะถูกนำเข้าไปในระยะบลาสโตซิสต์หรือรวมกับบลาสโตเมียร์ของมอรูลา เอ็มบริโอระยะเริ่มต้นไคเมอริกที่ได้รับด้วยวิธีนี้จะถูกปลูกถ่ายเข้าไปในตัวเมียที่เป็นผู้รับ และตัวผู้ที่มีเซลล์สืบพันธุ์ที่ไม่ถูกลบสำหรับยีนที่กำหนดนั้นจะถูกเลือกจากหนูแรกเกิด เทคโนโลยีนี้ถูกนำมาใช้เพื่อสร้างหนูที่ถูกน็อกเอาต์หลายสายพันธุ์ ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในชีววิทยาเชิงทดลองและการแพทย์เชิงทดลอง แบบจำลองทางชีววิทยาดังกล่าวถูกนำมาใช้เพื่อศึกษาความสำคัญของยีนบางชนิดในการพัฒนาตัวอ่อน รวมถึงบทบาทของยีนเหล่านี้ในกลไกของโรคในมนุษย์และสภาวะทางพยาธิวิทยา นอกจากนี้ สายพันธุ์สัตว์ที่ถูกน็อกเอาต์ยังใช้ในการทดสอบก่อนทางคลินิกของวิธีการบำบัดด้วยยีนแบบใหม่ ตัวอย่างเช่น การนำยีนกลายพันธุ์ปกติของยีนกลายพันธุ์เข้าไปในจีโนม ESC จะทำให้แก้ไขการกลายพันธุ์ที่ส่งผลต่อระบบเม็ดเลือดได้อย่างมีประสิทธิภาพ การนำยีนแปลกปลอมเข้าไปใน ESC ช่วยให้สร้างสายพันธุ์ของสัตว์ทดลองที่ดัดแปลงพันธุกรรมแบบโฮโมไซกัสได้อย่างรวดเร็ว อย่างไรก็ตาม ควรสังเกตว่าเทคนิคของการลบยีนรีคอมบิเนชั่นแบบกำหนดเป้าหมายได้รับการพัฒนาอย่างน่าเชื่อถือเฉพาะใน ESC ของหนูเท่านั้น การใช้ ESC ของหนูแบบน็อกเอาต์สองครั้ง ทำให้สามารถกำหนดบทบาทการทำงานของบริเวณคลัสเตอร์ยีนบนโครโมโซม 7 (สำเนาของบริเวณจีโนมบนโครโมโซม 19 ของมนุษย์) และบริเวณใกล้เคียงของโครโมโซม 11 (สำเนาของโครโมโซม 5g ของมนุษย์) ได้ การลบยีนเหล่านี้ใน ESC ของหนูทำให้สามารถประเมินการทำงานของแอนะล็อกในมนุษย์ได้

ความเป็นไปได้ในการศึกษาหน้าที่ของยีนการสร้างตัวอ่อนของมนุษย์ได้ขยายตัวขึ้น ซึ่งการถ่ายโอนยีนดังกล่าวเข้าไปในจีโนมของ ESC ของสัตว์ทดลองทำให้สามารถชี้แจงบทบาทของยีนเข้ารหัสในการสร้างและพัฒนาของ mesoderm ที่สร้างหัวใจ ซึ่งก็คือยีน pax-6 ในกระบวนการสร้างตัวอ่อนของตาได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง แผนที่แรกของการแสดงออกของยีนใน ESC ที่ยังไม่เจริญเต็มที่ของ teratocarcinoma และ blastocyst ของหนูกำลังถูกรวบรวม และได้รับการยืนยันการยับยั้งยีน transsignaling ใน ESC การรวมกันของ ESC ที่กลายพันธุ์ 60-80 ตัวและเซลล์ 20-30 เซลล์ของเอ็มบริโอก่อนการฝังตัวปกติของหนูจะนำไปสู่การพัฒนาของเอ็มบริโอไคเมอริกซึ่งอวัยวะเบื้องต้นประกอบด้วยเซลล์ผู้บริจาคและเซลล์ผู้รับ ซึ่งทำให้สามารถชี้แจงบทบาทของยีนที่ไม่รู้จักในกระบวนการสร้างตัวอ่อนและการสร้างอวัยวะได้ แผนผังการทำงานของยีนของเอ็มบริโอของหนูที่กำลังพัฒนาได้รับการเสริมด้วยข้อมูลเกี่ยวกับบทบาทของยีน sf-1 ในการสร้างต่อมหมวกไตและต่อมเพศ ยีน wt-1 ในการสร้างไต ยีนของตระกูล myoD ในการสร้างกล้ามเนื้อโครงร่าง และยีนของตระกูล gata-1-4 ในการจำกัดการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อพื้นฐานในการสร้างเม็ดเลือดแดงและเซลล์ลิมโฟโปอีซิส

การปิดการทำงานของยีนอัลลีลของมารดาและบิดาใน ESC โดยใช้เวกเตอร์รีคอมบิเนสทำให้สามารถชี้แจงหน้าที่ของยีนต่างๆ ในระยะเริ่มต้นของการสร้างตัวอ่อนได้ และเทคโนโลยีการถ่ายโอนยีนมนุษย์ที่ไม่รู้จักโดยตรงไปยัง ESC ของหนูมีส่วนช่วยในการค้นพบยีนกลายพันธุ์ใหม่ที่รับผิดชอบต่อการพัฒนาพยาธิวิทยาทางพันธุกรรมที่รุนแรง โดยใช้กระบวนการน็อกเอาต์ ความสำคัญที่จำเป็นของยีนบางตัวสำหรับการสร้างเนื้อเยื่อของตัวอ่อนได้รับการกำหนด: gata-4 - สำหรับกล้ามเนื้อหัวใจ, gata-1 - สำหรับกลุ่มเม็ดเลือดแดงของเนื้อเยื่อสร้างเม็ดเลือด, myoD - สำหรับกล้ามเนื้อโครงร่าง, brachyury - สำหรับเนื้อเยื่อมีโซเดิร์ม, เอนไซม์ทรานสคริปเทสจำกัด hnf3 และ hnf4 - สำหรับเซลล์ต้นกำเนิดของตับ, rag-2 - สำหรับการสร้างโคลนของ T และ B-lymphocyte (Repin, 2001) การลบยีนซ้ำใน ESC ทำให้สามารถเข้าถึงการศึกษาบทบาทการทำงานของยีนในชั้นเชื้อโรค การแบ่งส่วน และโฮมีโอซิสได้ และการปลูกถ่าย ESC ทำให้สามารถได้รับเอ็มบริโอลูกผสมข้ามสายพันธุ์ที่มีชีวิตได้ การใช้เทคนิคที่ปรับปรุงแล้วในการปลูกถ่าย ESC จากผู้บริจาครายเดียวเข้าไปในเอ็มบริโอ 8 เซลล์ พิสูจน์ให้เห็นถึงการเกิดไคเมอไรเซชันในระดับเซลล์ของอวัยวะต่างๆ มากมายของเอ็มบริโอผู้รับ ควรสังเกตว่าพบเซลล์ต้นกำเนิดของเนื้อเยื่อมนุษย์ในอวัยวะของหนูผู้รับหลังจากการนำเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดของมนุษย์เข้าไปในระยะบลาสโตซิสต์ ได้มีการพิสูจน์แล้วว่า ESC ที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างหมุนเวียนอยู่ในเลือดของเอ็มบริโอหนูในช่วงการสร้างอวัยวะ เป็นไปได้ว่าหน้าที่ทางชีววิทยาของ ESC อยู่ที่การจัดระเบียบเอ็มบริโอของระบบภูมิคุ้มกันในอนาคต ด้วยความช่วยเหลือของ ESCs แบบจำลองที่เหมาะสมของพยาธิวิทยาทางพันธุกรรมของมนุษย์ได้รับการจำลองในสภาพห้องปฏิบัติการ: แบบจำลองการน็อกเอาต์ยีน dystrophin สองครั้งคือ Duchenne muscular dystrophy ในหนู และการปิดยีน atm (การควบคุมการสังเคราะห์ chromatin signal kinase) - ataxia-telangectasia ในโรคทางพันธุกรรมที่ร้ายแรงนี้ในเด็ก ความเสื่อมของเซลล์ Purkinje ในสมองน้อยเกิดจากข้อบกพร่องในการซ่อมแซม DNA ซึ่งมาพร้อมกับการหดตัวของต่อมไทมัสเนื่องจากเซลล์ที่ขยายตัวตาย ภาพทางคลินิก พยาธิสรีรวิทยา และพยาธิสภาพของ ataxia-telangectasia ซึ่งจำลองโดยการใส่ข้อมูลทางพันธุกรรมทางพยาธิวิทยาลงใน ESCs ในหนู chimera สอดคล้องกับในมนุษย์ นอกเหนือจากโรคอะแท็กเซีย-เทลังเกตาเซียแล้ว การใช้ ESC และหนูน็อคเอาต์ ยังมีการพัฒนารูปแบบการทดลองของโรคมนุษย์แบบโฮโมไซกัสบางโรคที่ถ่ายทอดทางพันธุกรรมที่เกี่ยวข้องกับพยาธิสภาพของการเผาผลาญคาร์โบไฮเดรตและไขมัน การสลายตัวของกรดอะมิโน การขับถ่ายทองแดงและบิลิรูบิน ซึ่งช่วยขยายขีดความสามารถของการแพทย์ทดลองในขั้นตอนการทดสอบก่อนทางคลินิกของวิธีการใหม่ๆ ในการรักษาโรคของมนุษย์ที่เกี่ยวข้องอย่างมีนัยสำคัญ

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

การใช้ไซโตไฮบริดสลีสเต็มเซลล์

เซลล์ลูกผสมที่ได้จากการผสม ESC กับเซลล์ร่างกายเป็นแบบจำลองที่เหมาะสมและมีแนวโน้มดีสำหรับการศึกษาความสามารถในการแบ่งตัวของเซลล์ต้นกำเนิดและการรีโปรแกรมโครโมโซมของเซลล์ที่แยกความแตกต่าง ไซโตไฮบริดที่ได้จากการผสม ESC กับเซลล์ที่แยกความแตกต่างของสัตว์โตเต็มวัยทำให้สามารถศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างจีโนมของ "วัย" ที่แตกต่างกันได้ สถานการณ์ที่ไม่เหมือนใครเกิดขึ้นเมื่อโครโมโซมที่คล้ายคลึงกันซึ่งมีต้นกำเนิดจากเซลล์ในระยะการแยกความแตกต่างและระดับความเป็นผู้ใหญ่ที่แตกต่างกันอยู่ในนิวเคลียสเดียวกัน ซึ่งสามารถแลกเปลี่ยนสัญญาณควบคุมแบบทรานส์แอ็กทีฟได้อย่างง่ายดาย เป็นเรื่องยากที่จะคาดเดาว่าระบบเอพิเจเนติกซิสเรกูเลตของโครโมโซมที่คล้ายคลึงกันซึ่งก่อตัวขึ้นในระหว่างการพัฒนาของแต่ละบุคคลจะตอบสนองต่ออิทธิพลของสัญญาณทรานส์แอ็กทีฟที่แผ่ออกมาจากจีโนมที่เกี่ยวข้องกับตัวอ่อนอย่างไร นอกจากนี้ การแยกโครโมโซมของพ่อแม่ยังเกิดขึ้นในเซลล์ลูกผสม ซึ่งทำให้เราสามารถศึกษาปฏิสัมพันธ์ของจีโนมที่ระดับโครโมโซมแต่ละตัวได้ นั่นคือ การระบุการมีส่วนร่วมของโครโมโซมเฉพาะในการรักษาความสามารถในการแบ่งตัวทางพันธุกรรม หรือในทางกลับกัน คือ ทางออกจากการแยกความแตกต่าง

ไซโตไฮบริดที่ได้จากการผสมเซลล์เทอราโทคาร์ซิโนมาที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างกับเซลล์โซมาติกที่แยกความแตกต่างได้นั้นใช้เป็นแบบจำลองการทดลองครั้งแรกสำหรับการศึกษาปฏิสัมพันธ์ของจีโนมที่มี "ประวัติการพัฒนา" ที่แตกต่างกัน ในบางกรณี เซลล์ไฮบริดดังกล่าวยังคงรักษาคุณสมบัติที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างไว้ในระดับที่ค่อนข้างสูง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เซลล์ไฮบริดเทอราโทคาร์ซิโนมา-โซมาติกในร่างกายกระตุ้นให้เกิดเทอราโทมาที่แท้จริงซึ่งประกอบด้วยอนุพันธ์ของชั้นเชื้อโรคทั้งสามชั้น และในหลอดทดลอง เซลล์เหล่านี้ก่อตัวเป็นเอ็มบริออยด์บอดีในวัฒนธรรมการแขวนลอย แม้แต่ในไซโตไฮบริดระหว่างสปีชีส์ของประเภทนี้ ก็ยังพบการมีอยู่ของแอนติเจนของเอ็มบริโอในกรณีที่พันธมิตรทางโซมาติกในการหลอมรวมกับเซลล์เทอราโทคาร์ซิโนมาคือลิมโฟไซต์หรือไทโมไซต์ เป็นที่น่าสังเกตว่าไซโตไฮบริดที่สร้างขึ้นโดยการหลอมเซลล์เทอราโทคาร์ซิโนมากับไฟโบรบลาสต์สอดคล้องกับไฟโบรบลาสต์ในฟีโนไทป์

ข้อเท็จจริงที่สำคัญที่สุดที่ได้รับการยืนยันก็คือ ในเซลล์ลูกผสมเทอราโตคาร์ซิโนมา-โซมาติก มีสัญญาณของการรีโปรแกรมจีโนมเซลล์ที่แยกความแตกต่างแล้ว ซึ่งมีลักษณะเฉพาะคือ การทำงานของยีนเดี่ยวหรือโครโมโซม X ที่ไม่ทำงานของคู่หูโซมาติกใหม่ ดังนั้น ผลการศึกษาเกี่ยวกับไซโตไฮบริดของเซลล์ประเภทเทอราโตคาร์ซิโนมา-โซมาติกจึงบ่งชี้ว่าความสามารถในการแปรสภาพมักจะถูกเก็บรักษาไว้ในเซลล์ลูกผสม และมีสัญญาณของการรีโปรแกรมจีโนมคู่หูโซมาติก

ในการทดลองเกี่ยวกับการได้รับเซลล์ลูกผสมของตัวอ่อนภายในสายพันธุ์โดยการผสมผสานเซลล์ ESC ของหนูเข้ากับเซลล์ม้ามโตเต็มวัย ลักษณะของไซโตไฮบริดดังกล่าวได้รับการศึกษา การแยกโครโมโซมของพ่อแม่ได้รับการวิเคราะห์ และความสามารถในการแบ่งตัวของจีโนมลูกผสมได้รับการประเมิน เซลล์ลูกผสมภายในสายพันธุ์ที่ได้รับจากการผสมผสานเซลล์เทอราโทคาร์ซิโนมาเข้ากับเซลล์โซมาติกมักมีลักษณะเฉพาะคือมีการแยกโครโมโซมในระดับต่ำโดยมีแคริโอไทป์แบบสี่โครโมโซมหรือเกือบสี่โครโมโซม มีการสังเกตองค์ประกอบโครโมโซมที่คล้ายกันในไซโตไฮบริดระหว่างการหลอมรวมเซลล์เชื้อพันธุ์หลักกับลิมโฟไซต์ ในเวลาเดียวกัน เซลล์ลูกผสมระหว่างสายพันธุ์ที่ได้รับจากการผสมผสานเซลล์เทอราโทคาร์ซิโนมาของหนูเข้ากับลิมโฟไซต์มิงค์แสดงให้เห็นการแยกโครโมโซมของคู่โซมาติกอย่างเข้มข้น

ขั้นตอนใหม่เชิงคุณภาพในการศึกษาการแยกโครโมโซมของพ่อแม่ในลูกผสมภายในสายพันธุ์เริ่มต้นขึ้นหลังจากการพัฒนาวิธีการวิเคราะห์ไมโครแซทเทลไลต์โดยใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ซึ่งทำให้สามารถพบเครื่องหมายหลายร้อยตัวสำหรับโครโมโซมของหนูแต่ละตัว ช่วยให้สามารถแยกแยะคู่โครโมโซมที่คล้ายคลึงกันในเซลล์ลูกผสมได้อย่างน่าเชื่อถือ

การผสม ESC (เซลล์ HM-1 ที่ขาดกิจกรรมของไฮโปแซนทีนฟอสโฟไรโบซิลทรานสเฟอเรส 2n = 40, XY, แยกจากระยะบลาสโตซิสต์ของหนู 129/01a) กับเซลล์ม้ามของหนู DD/c ที่มีรูปร่างคล้ายกัน ทำให้สามารถได้โคลนลูกผสมชุดหนึ่งที่มีสัณฐานวิทยาคล้ายคลึงกับ ESC ได้ โคลนทั้งหมดถูกแยกบนอาหารเลี้ยงเชื้อแบบเลือกสรรซึ่งเซลล์ที่มีไฮโปแซนทีนฟอสโฟไรโบซิลทรานสเฟอเรสเท่านั้นที่สามารถเจริญเติบโตได้ การวิเคราะห์อิเล็กโทรโฟเรซิสแสดงให้เห็นว่าโคลนทั้งหมดมีรูปแบบอัลลีลของไฮโปแซนทีนฟอสโฟไรโบซิลทรานสเฟอเรสที่เป็นลักษณะเฉพาะของหนู DD/c การวิเคราะห์ไซโตเจเนติกส์แสดงให้เห็นว่าโคลนลูกผสมสามในสี่โคลนมีชุดโครโมโซมที่เกือบเป็นดิพลอยด์ โคลนที่เกือบเป็นเททราพลอยด์โคลนหนึ่งมีประชากรเซลล์ลูกผสมสองกลุ่ม โดยกลุ่มหนึ่งเป็นเททราพลอยด์ และกลุ่มที่สองซึ่งมีขนาดเล็กกว่าเป็นดิพลอยด์

การวิเคราะห์ไมโครแซทเทลไลต์ ซึ่งช่วยให้สามารถแยกแยะคู่โครโมโซมที่คล้ายคลึงกันของหนู 129/01a และ DD/c ในโคลนลูกผสมที่มีชุดโครโมโซมเกือบเป็นดิพลอยด์ แสดงให้เห็นว่าในโคลน 2 โคลน มีการกำจัดออโตโซมของคู่หูโซมาติกอย่างชัดเจน ออโตโซมส่วนใหญ่ในโคลน HESS2 และ HESS3 มีเครื่องหมายของสาย 129/01a หรือคู่หูที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่าง ข้อยกเว้นคือโครโมโซม 1 และ I ในโคลน HESS2 และ HESS3 พร้อมกับเครื่องหมายของเซลล์ HM-1 เครื่องหมายของคู่หูโซมาติกมีอยู่ในปริมาณเล็กน้อย ผลลัพธ์ดังกล่าวอาจสะท้อนถึงการแยกโครโมโซม 1 และ I ของคู่หูโซมาติกที่ไม่สมบูรณ์ และสอดคล้องกับข้อมูลไซโทเจเนติกที่พบว่าไตรโซมีสำหรับโครโมโซมเหล่านี้พบใน 30-40% ของเซลล์ในโคลน HESS2 และ HESS3 โคลน HESS4 มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในองค์ประกอบของโครโมโซม: ออโตโซมจำนวนมากในโคลนนี้มีต้นกำเนิดมาจากจีโนม ESC (โครโมโซม 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 และ 17) แต่โครโมโซม 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 และ 19 แสดงโดยโฮโมล็อกของพ่อแม่ทั้งสอง อัตราส่วนเชิงปริมาณของไมโครแซทเทลไลต์ที่ทำเครื่องหมายโครโมโซมโฮโมล็อกเหล่านี้อยู่ที่ประมาณ 1:1 ซึ่งทำให้ผู้เขียนสามารถสันนิษฐานได้ว่าโฮโมล็อกตัวหนึ่งมีต้นกำเนิดมาจากจีโนม ESC และอีกตัวหนึ่งมาจากเซลล์ที่แยกความแตกต่างแล้ว ในโคลนย่อยบางโคลนของโคลน HESS4 มีเพียงเครื่องหมายของโครโมโซม 18 และ 19 ของคู่โซมาติกเท่านั้นที่มีอยู่ ผลลัพธ์ที่ได้บ่งชี้ว่าในเซลล์ของโคลน HESS4 นอกเหนือจากการแยกโครโมโซมของคู่หูร่างกายแล้ว ยังมีการกำจัดโฮโมล็อกหนึ่งตัวหรือทั้งสองตัวของโครโมโซมที่ระบุไว้ข้างต้นของจีโนมที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างอีกด้วย นั่นคือ มีการแยกโครโมโซมของพ่อแม่ทั้งสองแบบในทวิภาคี ซึ่งถือเป็นปรากฏการณ์ที่ผิดปกติอย่างมาก เนื่องจากการแยกโครโมโซมของพ่อแม่เพียงฝ่ายเดียวเป็นลักษณะเฉพาะของไซโตไฮบริด

นอกจากนี้ หลังจากผ่านครั้งที่ 20 โคลนของเซลล์ลูกผสมทั้งหมดจะมีเพียงเครื่องหมายของโครโมโซม X ของคู่โซมาติกเท่านั้น กล่าวคือ โครโมโซม X ของ ESC ถูกแทนที่ด้วยโครโมโซม X ของคู่โซมาติกในโคลน ข้อเท็จจริงที่สำคัญนี้ได้รับการยืนยันโดยข้อมูลไฮบริดิเซชันในสถานที่ใช้โพรบที่มีฉลาก FITC เฉพาะสำหรับโครโมโซม X ของเมาส์: ตรวจพบสัญญาณบวกบนโครโมโซมเดียวเท่านั้น ควรสังเกตว่าในระยะเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยง (ก่อนผ่านครั้งที่ 15) ตามข้อมูลไซโทเจเนติก เซลล์จำนวนมากมีโครโมโซม X สองตัว ดังนั้น การใช้สื่อเลือกช่วยให้สามารถจัดการองค์ประกอบโครโมโซมของเซลล์ลูกผสมและคัดเลือกโคลนที่มีโครโมโซมเดี่ยวของคู่โซมาติกกับพื้นหลังของจีโนม ESC ได้

เนื่องจากลักษณะเฉพาะตัวของจีโนมไซโตไฮบริดคือการแปลตำแหน่งของจีโนมของพ่อแม่ไว้ในนิวเคลียสหนึ่ง จึงเกิดคำถามขึ้นโดยธรรมชาติเกี่ยวกับการรักษาคุณสมบัติ pluripotent ของจีโนมเอ็มบริโอในไฮบริดเซลล์โซมาติก ESC ภายใต้เงื่อนไขของการสัมผัสอย่างใกล้ชิดกับจีโนมของเซลล์ที่แยกความแตกต่างแล้ว ทางสัณฐานวิทยา ไซโตไฮบริดของ ESC และเซลล์โซมาติกมีความคล้ายคลึงกับสายพันธุ์ ESC ของพ่อแม่ การประเมิน pluripotency แสดงให้เห็นว่าโคลนทั้งหมดที่มีชุดโครโมโซมเกือบเป็นดิพลอยด์สามารถสร้างร่างกายเอ็มบริออยด์ในวัฒนธรรมการแขวนลอยซึ่งมีอนุพันธ์ของชั้นเชื้อโรคสามชั้นอยู่

เซลล์ลูกผสมส่วนใหญ่มีแอนติเจน ECMA-7 ซึ่งเป็นเครื่องหมายที่มีลักษณะเฉพาะของเอ็มบริโอของหนูในระยะแรก และยังมีกิจกรรมฟอสฟาเตสอัลคาไลน์สูงอีกด้วย ข้อมูลที่น่าเชื่อถือที่สุดเกี่ยวกับคุณสมบัติ pluripotent สูงของเซลล์ลูกผสมนั้นได้มาจากการทดลองเกี่ยวกับการรับไคเมร่าฉีดชุดหนึ่งซึ่งเกี่ยวข้องกับเซลล์ลูกผสมของโคลน HESS2 การวิเคราะห์เครื่องหมายทางชีวเคมีแสดงให้เห็นว่าลูกหลานของเซลล์ลูกผสมของผู้บริจาคนั้นมีอยู่ในเนื้อเยื่อส่วนใหญ่ของไคเมร่า ดังนั้น เซลล์ลูกผสมที่ได้จากการผสม ESC กับเซลล์ที่แยกความแตกต่างทางร่างกายจะคงความสามารถในการ pluripotency ไว้ในระดับสูง รวมถึงความสามารถในการสร้างไคเมร่าเมื่อฉีดเข้าไปในโพรงบลาสโตซิสต์

โคลน HESS2 และ HESS4 แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในองค์ประกอบของโครโมโซมของพ่อแม่ แต่มีคุณสมบัติในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างที่คล้ายคลึงกัน อาจสันนิษฐานได้ว่าการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างในจีโนมลูกผสมแสดงออกมาในลักษณะลักษณะเด่น แต่เป็นไปได้ว่าโครโมโซมของจีโนมของตัวอ่อนไม่ได้มีส่วนเกี่ยวข้องในกระบวนการรักษาการเปลี่ยนแปลงหลายอย่าง หากสมมติฐานนี้ถูกต้อง ก็คาดหวังได้ว่าการกำจัดโครโมโซมบางส่วนของคู่หูในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างออกจากจีโนมของเซลล์ลูกผสมจะไม่มาพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงในสถานะการเปลี่ยนแปลงหลายอย่าง ในกรณีนี้ การวิเคราะห์การแยกโครโมโซมของพ่อแม่ในเซลล์ลูกผสมของตัวอ่อนจะทำให้เราสามารถระบุโครโมโซมที่รับผิดชอบในการควบคุมการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างของเซลล์ตัวอ่อนได้อย่างใกล้ชิด

O. Serov et al. (2001) ไม่พบลูกหลานใดๆ ในลูกหลาน 50 ตัวที่ได้จากการผสมพันธุ์ไคเมร่ากับหนูปกติที่มีจีโนไทป์หนู 129/01a และมีโครโมโซม X ของหนู DD ผู้เขียนเชื่อว่าสาเหตุนี้เกิดจากการลดลงของความสามารถในการแบ่งตัวของเซลล์ลูกผสมภายใต้อิทธิพลของจีโนมโซมาติก คำอธิบายทางเลือกอาจเป็นผลเชิงลบของทริโซมีต่อออโตโซมบางชนิดและความไม่สมดุลของโครโมโซมเพศ (พบ XXY ในเซลล์จนถึงช่วงที่ 15) ในเซลล์ลูกผสมระหว่างไมโอซิส เป็นที่ทราบกันดีว่าเซลล์ XXY ไม่สามารถผ่านไมโอซิสและสร้างเซลล์สืบพันธุ์ได้ ทริโซมีอาจทำให้กิจกรรมการแพร่พันธุ์ของเซลล์ลูกผสมลดลง ซึ่งส่งผลให้ความได้เปรียบเชิงคัดเลือกในการพัฒนาไคเมร่าอาจตกอยู่กับเซลล์ของตัวอ่อนตัวรับ ดังนั้น เพื่อการประเมินศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมของเซลล์ลูกผสมอย่างเหมาะสม จำเป็นต้องได้รับโคลนลูกผสมที่มีชุดโครโมโซมดิพลอยด์ปกติ

ในการทดลองของ O. Serov และผู้เขียนร่วม (2001) ได้มีการสาธิตความเป็นไปได้ของการรีโปรแกรมโครโมโซม X ของเซลล์โซมาติกในจีโนมของเซลล์ลูกผสมเป็นครั้งแรก ข้อสรุปของผู้เขียนนี้ตามมาจากการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน hprt (เครื่องหมายโครโมโซม X) ในไคเมร่า: ตรวจพบการมีอยู่ของรูปแบบอัลลีลของ hprt ของหนู DD/c ในเนื้อเยื่อไคเมร่าที่วิเคราะห์ทั้งหมด เป็นการเหมาะสมที่จะเน้นย้ำว่าหลังจากนำเซลล์ลูกผสมเข้าไปในโพรงบลาสโตซิสต์แล้ว ไซโตไฮบริดจะตกอยู่ในสภาวะที่ไม่เลือก และการรักษาโครโมโซม X ไว้ในจีโนมของเซลล์ลูกผสมหมายความว่าโครโมโซม X ได้กลายเป็นส่วนประกอบที่จำเป็น และจีโนมจะไม่แยกความแตกต่างจากโครโมโซม Y ของคู่หูที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่าง

เมื่อสรุปผลการวิเคราะห์ปฏิสัมพันธ์ระหว่างจีโนมโซมาติกและพลูริโพเทนต์ในเซลล์เอ็มบริโอไฮบริด ผู้เขียนสรุปได้ว่าในไซโตไฮบริดบางชนิด พลูริโพเทนต์เป็นลักษณะเด่น จีโนมไฮบริดสามารถรีโปรแกรมโครโมโซมแต่ละอันของเซลล์ที่แยกความแตกต่างได้ ซึ่งอย่างไรก็ตาม ไม่ตัดความเป็นไปได้ของผลย้อนกลับของจีโนมโซมาติกต่อพลูริโพเทนต์ของจีโนมเอ็มบริโอ เมื่อเพาะเลี้ยงเซลล์ไฮบริด การเหนี่ยวนำให้เกิดการแยกความแตกต่างเกิดขึ้นบ่อยกว่าในสายพ่อแม่ดั้งเดิมของเซลล์เอ็มบริโอไฮบริด HM-1 อย่างมีนัยสำคัญ ผลที่คล้ายกันนี้สังเกตได้ระหว่างการก่อตัวของกลุ่มโคโลนีหลัก กลุ่มโคโลนีหลักจำนวนมากของเซลล์เอ็มบริโอไฮบริดจะแยกความแตกต่างในระยะเริ่มต้นของการสร้าง โดยมีการสูญเสียโคลนจำนวนมากระหว่างการคัดเลือกและการสืบพันธุ์

ดังนั้น ไซโตไฮบริดที่สร้างขึ้นโดยการหลอมรวมของ ESC กับเซลล์โซมาติก แม้จะมีการสัมผัสใกล้ชิดกับจีโนมของเซลล์ที่แยกความแตกต่างแล้ว แต่ยังคงรักษาความสามารถในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างไว้ได้ในฐานะคุณสมบัติเฉพาะของจีโนมของตัวอ่อน ยิ่งไปกว่านั้น ในเซลล์ลูกผสมดังกล่าว การรีโปรแกรมโครโมโซมแต่ละตัวที่มีต้นกำเนิดจากเซลล์ที่แยกความแตกต่างแล้วนั้นเป็นไปได้ ยังไม่ชัดเจนว่าคุณสมบัติความสามารถในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างของจีโนมของตัวอ่อนยังคงอยู่ในเซลล์ลูกผสมในระดับใด โดยเฉพาะอย่างยิ่งความสามารถในการมีส่วนร่วมในการก่อตัวของเซลล์สืบพันธุ์ในไคเมร่า ซึ่งต้องใช้เซลล์ลูกผสมของตัวอ่อนที่มีแคริโอไทป์ปกติ ไม่ว่าในกรณีใด เซลล์ลูกผสมของตัวอ่อนที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างสามารถกลายเป็นแบบจำลองทางพันธุกรรมที่แท้จริงสำหรับการระบุโครโมโซมที่เกี่ยวข้องกับการรักษาความสามารถในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างหรือการควบคุม เนื่องจากการแยกโครโมโซมของพ่อแม่แบบทวิภาคีอาจให้โอกาสดังกล่าวได้

การศึกษาปรากฏการณ์ที่ O. Serov et al. (2001) ให้คำจำกัดความว่าเป็น "หน่วยความจำของโครโมโซม" นั้นน่าสนใจไม่แพ้กัน ในจีโนมลูกผสม โครโมโซมคู่กันมีโครงร่างทางเลือกสองแบบ คือ โครโมโซมคู่กันของคู่โซมาติกเคยผ่านกระบวนการแยกความแตกต่างมาแล้ว ในขณะที่ในโครโมโซมคู่ของคู่พหุศักยภาพ กระบวนการนี้เพิ่งเริ่มต้นขึ้นเท่านั้น ดังนั้น การรักษาคุณสมบัติพหุศักยภาพสูงของเซลล์ลูกผสมจึงบ่งชี้ว่าโครงร่าง "พหุศักยภาพ" ของโครโมโซมคู่ ESC นั้นเสถียรเพียงพอในจีโนมลูกผสม แม้จะมีอิทธิพลของปัจจัยการกระทำที่แผ่ออกมาจากคู่โซมาติกก็ตาม สัญญาณของการรีโปรแกรมโครโมโซมคู่กันของจีโนมที่แยกความแตกต่างแล้วที่อธิบายไว้ข้างต้นในระหว่างการพัฒนาของไคเมร่าไม่ได้ตัดความเป็นไปได้ที่ในระยะแรกของการสร้างและการเพาะเลี้ยงไซโตไฮบริดในหลอดทดลอง โครโมโซมคู่กันจะยังคงสถานะที่ได้รับมาในระหว่างการแยกความแตกต่างในร่างกาย ตามข้อมูลที่ได้รับล่าสุด เมื่อเซลล์ลูกผสมเอ็มบริโอถูกย้ายไปยังสภาพแวดล้อมที่ไม่เลือก เซลล์เหล่านี้จะแสดงการกำจัดโครโมโซมของคู่โซมาติกอย่างเข้มข้น กล่าวคือ จีโนมของเซลล์ลูกผสมสามารถแยกแยะโฮโมล็อกได้อย่างง่ายดายหลังจากเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองเป็นเวลา 10-15 รอบ ดังนั้น เซลล์ลูกผสมเอ็มบริโอจึงเป็นแบบจำลองการทดลองที่มีแนวโน้มดีสำหรับการศึกษาไม่เพียงแค่คุณสมบัติพื้นฐานของจีโนมเอ็มบริโอ เช่น ความสามารถในการแบ่งตัวของเซลล์เท่านั้น แต่ยังรวมถึงทางเลือกอื่นด้วย เช่น การแยกตัวของเอ็มบริโอ

ประสิทธิภาพการรักษาของการปลูกถ่ายเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน

ก่อนที่จะวิเคราะห์ประสิทธิภาพการรักษาของการปลูกถ่าย ESC และอนุพันธ์ของ ESC เราจะสรุปเนื้อหาข้างต้น ความสามารถของ ESC ในแง่ของการนำการสร้างตัวอ่อนมาใช้ในหลอดทดลองอย่างเต็มรูปแบบนั้นไม่เพียงพอ เนื่องจากข้อบกพร่องในการพัฒนาในกรณีนี้เกิดจากการไม่มีเซลล์ต้นกำเนิดของเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน ซึ่งเกิดขึ้นในร่างกายโดยอิสระและไม่ขึ้นกับ ESC ศักยภาพทางพันธุกรรมของ ESC น้อยกว่าศักยภาพทางพันธุกรรมของไซโกต ดังนั้น ESC จึงไม่ได้ถูกใช้โดยตรงในการโคลนตัวอ่อน ศักยภาพทางชีววิทยาเฉพาะตัวของ ESC ในฐานะเซลล์เดียวที่โปรแกรมการพัฒนาถูกนำไปใช้อย่างเต็มที่ในการใช้งานที่สอดคล้องกันนั้นถูกใช้ในการศึกษาการทำงานของยีน ด้วยความช่วยเหลือของ ESC ชุดสัญญาณชุดแรกที่กระตุ้นการแสดงออกของยีนในระยะเริ่มต้นและระยะหลังที่เข้ารหัสการพัฒนาของชั้นเชื้อโรคทั้งสามชั้นจะถูกถอดรหัส การรักษาความสามารถในการแบ่งตัวของเซลล์ของ ESC ในหลอดทดลองทำให้เซลล์เหล่านี้เป็นเครื่องมือเฉพาะตัวสำหรับการฟื้นฟูเซลล์ ซึ่งสามารถทดแทนเซลล์ที่สูญเสียไปโดยอัตโนมัติในกรณีที่อวัยวะและเนื้อเยื่อได้รับความเสียหาย ในสถานการณ์สมมติในอุดมคติ อาจสันนิษฐานได้ว่า “... เมื่อทำการปลูกถ่าย ESC ของผู้บริจาค โปรแกรมที่อัดแน่นจะถูกถ่ายโอนไปยังร่างกายของผู้รับ ซึ่งภายใต้เงื่อนไขที่เอื้ออำนวย จะเกิดขึ้นได้ในการสร้างเนื้อเยื่อใหม่'7 ซึ่งสามารถ “... ผสานเข้ากับร่างกายของผู้รับได้อย่างมีประสิทธิภาพทั้งในระดับสัณฐานวิทยาและการทำงาน”

ตามธรรมชาติแล้ว หลังจากการพัฒนาของวิธีการสำหรับการแยกตัวของเซลล์ต้นกำเนิดจากเซลล์... เทอราโทมาเกิดขึ้นเมื่อมีการฉีด ESC เข้าใต้ผิวหนังในหนูที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง เมื่อนำ ESC แขวนลอยไปไว้ใต้แคปซูลของอัณฑะในหนูที่มีเซลล์สืบพันธุ์แบบอาศัยเพศ ก็จะเกิดเทอราโทมาด้วย ซึ่งประกอบด้วยเนื้อเยื่อต่าง ๆ โดยเซลล์เหล่านั้นเป็นอนุพันธ์ของชั้นเชื้อโรคทั้งสามชั้น ในเทอราโทมาดังกล่าว กระบวนการลดขนาดอวัยวะเกิดขึ้นได้น้อยมาก

การศึกษาจำนวนหนึ่งให้ข้อมูลเกี่ยวกับผลลัพธ์เชิงบวกของการปลูกถ่ายอนุพันธ์ ESC ระยะเริ่มต้นให้กับสัตว์ที่มีพยาธิวิทยาในการทดลอง การปลูกถ่ายเซลล์ประสาทโดยใช้อนุพันธ์ ESC กำลังได้รับการพัฒนาเพิ่มเติมในการทดลองและการทดลองทางคลินิกครั้งแรกเพื่อแก้ไขความผิดปกติของการทำงานของสมองและการบาดเจ็บที่กระดูกสันหลัง และเพื่อรักษาโรคไซริงโกไมเอเลียและโรคปลอกประสาทเสื่อมแข็ง (Repin, 2001) ด้วยการถือกำเนิดของเทคนิคการสร้างเซลล์ประสาทในหลอดทดลองจาก ESC แทนที่จะใช้เนื้อเยื่อสมองของตัวอ่อน วิธีการต่างๆ จึงได้รับการพัฒนาสำหรับการปลูกถ่ายอนุพันธ์ของนิวโรสเฟียร์ที่ได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อประสาทของตัวอ่อน สารแขวนลอยสำหรับการปลูกถ่ายดังกล่าวมีความเป็นเนื้อเดียวกันมากกว่าอย่างมีนัยสำคัญและมีเซลล์ประสาทและเซลล์เกลียที่ทำหน้าที่ตั้งต้น

การเติมกรดเรตินอยด์ในปริมาณ 10 μg/ml ลงในอาหารเลี้ยงเชื้ออย่างสม่ำเสมอเป็นเวลา 6 สัปดาห์ เซลล์ประสาทหลังไมโทซิสมากกว่า 80% จะก่อตัวขึ้นในเซลล์มะเร็งเอ็มบริโอ-เทอราโต-คาร์ซิโนมาของมนุษย์ NTERA-2 เซลล์ประสาทที่โตเต็มที่จะถูกจัดเรียงแบบไหลและติดฉลากด้วยเครื่องหมายภูมิคุ้มกัน ซึ่งจะทำให้เซลล์ประสาทที่เหลือของเทอราโตคาร์ซิโนมาและเซลล์ที่ยังไม่โตเต็มที่ถูกกำจัดออกไปได้ หลังจากการปลูกถ่ายเซลล์ประสาทเหล่านี้เข้าไปในบริเวณต่างๆ ของสมองของสัตว์ทดลอง เซลล์ประสาทเหล่านี้ไม่เพียงแต่จะอยู่รอดเท่านั้น แต่ยังรวมเข้ากับเครือข่ายประสาทในระดับภูมิภาคอีกด้วย ในสัตว์ที่มีแบบจำลองการทดลองของข้อบกพร่องของระบบประสาทส่วนกลางในบริเวณนั้น การปลูกถ่ายเซลล์ประสาทจะช่วยลดอาการทางคลินิกของโรคต่างๆ ในมนุษย์ เช่น ผลที่ตามมาของการบาดเจ็บที่สมอง โรคหลอดเลือดสมอง โรคไมอีลินเสื่อม ข้อบกพร่องทางพันธุกรรมในการพัฒนาของสมองน้อย โรคของการสะสมของไขมันและโพลีแซ็กคาไรด์

เพื่อปรับกระบวนการสร้างใหม่ในโรคเสื่อมของระบบประสาทส่วนกลางให้เหมาะสมที่สุด จึงมีการพัฒนาเทคโนโลยีในการรับโอลิโกเดนโดรไซต์ที่สร้างไมอีลินจากเซลล์ ESC ขั้นตอนแรกโดยทั่วไปประกอบด้วยการเพิ่มจำนวนเซลล์ ESC โดยการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่จำเป็นสำหรับการปลูกถ่าย ในขั้นตอนที่สอง เซลล์จะถูกแยกเป็นเซลล์ตั้งต้นโอลิโกเดนโดรไซต์ที่สร้างไมอีลินโดยมีเป้าหมาย ซึ่งควบคุมโดยแอนติเจนมาร์กเกอร์ที่เลือกสรร

โอกาสบางประการกำลังเปิดกว้างสำหรับการใช้อนุพันธ์ ESC เพื่อพัฒนาวิธีการแก้ไขภูมิคุ้มกันบกพร่องที่เกิดจากข้อบกพร่องทางพันธุกรรมในการเจริญเติบโตของต่อมไทมัส ในการศึกษากับหนูที่ถูกน็อกเอาต์ (rag 1) ที่มีข้อบกพร่องทางยีนที่ถูกเหนี่ยวนำ - การหยุดชะงักของกลไกการรวมตัวใหม่ของตำแหน่ง V(D)J ของยีน TCR ส่งผลให้สูญเสียการทำงานของเซลล์ทีลิมโฟไซต์ การปลูกถ่ายอนุพันธ์ ESC ในระยะเริ่มต้นเข้าไปในต่อมไทมัสของสัตว์ช่วยฟื้นฟูการเจริญเติบโตของกลุ่มประชากรปกติของโคลนภูมิคุ้มกันที่รับผิดชอบต่อภูมิคุ้มกันของเซลล์ การทดลองทางคลินิกในการปลูกถ่าย ESC ที่สร้างไว้ล่วงหน้าในหลอดทดลองเพื่อรักษาโรคโลหิตจางทางพันธุกรรมที่ร้ายแรงในเด็กกำลังอยู่ระหว่างดำเนินการ

การคัดค้านการนำเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนมนุษย์มาใช้ในคลินิกอย่างรวดเร็วนั้นขึ้นอยู่กับจำนวนเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนมนุษย์ที่เสถียรและความจำเป็นในการทำให้เซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนมนุษย์เป็นมาตรฐาน เพื่อเพิ่มความบริสุทธิ์ของเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนมนุษย์ที่ได้มาตรฐาน รวมถึงเซลล์ต้นกำเนิดมนุษย์ที่โตเต็มวัย จึงมีการเสนอให้ใช้การคัดเลือกเซลล์ต้นกำเนิดจากการวิเคราะห์ทางพันธุกรรมระดับโมเลกุลของดีเอ็นเอซ้ำแบบเรียงต่อกันสั้นๆ นอกจากนี้ ยังจำเป็นต้องทดสอบเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนมนุษย์เพื่อดูว่ามีการเรียงตัวของโครโมโซมผิดปกติและกลายพันธุ์หรือไม่ ซึ่งมีโอกาสเกิดขึ้นได้ภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงเซลล์ค่อนข้างสูง มีการเสนอวิทยานิพนธ์เกี่ยวกับการทดสอบคุณสมบัติของเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนมนุษย์และเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพในระดับภูมิภาคทุกประเภท เนื่องจากการขยายพันธุ์ในหลอดทดลองอาจนำไปสู่การเกิดลักษณะใหม่ที่ไม่มีอยู่ในเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนมนุษย์หรือเนื้อเยื่อที่แน่นอน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง สันนิษฐานว่าการเพาะเลี้ยงในระยะยาวในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีไซโตไคน์จะทำให้เซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนมนุษย์เข้าใกล้เซลล์เนื้องอกมากขึ้น เนื่องจากเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนมนุษย์จะเกิดการเปลี่ยนแปลงที่คล้ายคลึงกันในเส้นทางการควบคุมวงจรของเซลล์ โดยได้รับความสามารถในการแบ่งเซลล์ได้ไม่จำกัดจำนวนครั้ง ผู้เขียนบางคนพิจารณาถึงศักยภาพในการพัฒนาเนื้องอกโดยพิจารณาจากการปลูกถ่ายอนุพันธ์ของเซลล์ต้นกำเนิดเอ็มบริโอในระยะเริ่มต้นเข้าสู่มนุษย์ว่าเป็นการประมาท ในความเห็นของพวกเขา การใช้ลูกหลานที่มุ่งมั่นของเซลล์ต้นกำเนิดเอ็มบริโอ เช่น สายเซลล์ต้นกำเนิดที่แยกความแตกต่างได้นั้นปลอดภัยกว่ามาก อย่างไรก็ตาม ในปัจจุบันยังไม่มีการพัฒนาวิธีการที่เชื่อถือได้สำหรับการได้รับสายเซลล์มนุษย์ที่เสถียรซึ่งแยกความแตกต่างได้ในทิศทางที่ต้องการ

ด้วยเหตุนี้ ข้อมูลมากขึ้นเรื่อยๆ เกี่ยวกับผลการรักษาเชิงบวกของการปลูกถ่ายอนุพันธ์เซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนมนุษย์จึงปรากฏในเอกสารทางวิชาการ อย่างไรก็ตาม การศึกษาเหล่านี้จำนวนมากกำลังถูกตรวจสอบและวิพากษ์วิจารณ์ นักวิจัยบางคนเชื่อว่าผลลัพธ์ของการทดลองทางคลินิกในระยะเริ่มต้นนั้นมีลักษณะเบื้องต้นและบ่งชี้เพียงว่าเซลล์ต้นกำเนิดสามารถส่งผลดีต่อการรักษาทางคลินิกของโรคเฉพาะได้ ดังนั้น จึงจำเป็นต้องได้รับข้อมูลเกี่ยวกับผลลัพธ์ในระยะไกลของการปลูกถ่ายเซลล์ ขั้นตอนการพัฒนาของการปลูกถ่ายประสาททางคลินิกถูกอ้างถึงเป็นข้อโต้แย้ง ในตอนแรก สิ่งพิมพ์เกี่ยวกับประสิทธิภาพสูงของการปลูกถ่ายชิ้นส่วนสมองของตัวอ่อนในโรคพาร์กินสันปรากฏให้เห็นในเอกสารทางวิชาการ แต่หลังจากนั้นก็เริ่มมีรายงานที่ปฏิเสธประสิทธิภาพการรักษาของเนื้อเยื่อประสาทของตัวอ่อนหรือทารกในครรภ์ที่ปลูกถ่ายเข้าไปในสมองของผู้ป่วย

การทดลองทางคลินิกครั้งแรกดำเนินการเพื่อประเมินความปลอดภัยของการปลูกถ่ายเซลล์ประสาทที่ได้จากเซลล์ประสาทเทอราโตคาร์ซิโนมา NTERA-2 ซึ่งเซลล์ที่ยังไม่โตเต็มที่จะถูกทำให้แพร่กระจายในวัฒนธรรมจนกระทั่งมีมวลเซลล์สะสม 100 ล้านเซลล์ เซลล์บางส่วนที่ได้รับด้วยวิธีนี้จะถูกใช้เพื่อกำหนดลักษณะทางฟีโนไทป์และกำหนดสิ่งเจือปนในเซลล์ รวมถึงทดสอบการปนเปื้อนที่อาจเกิดขึ้นจากไวรัสและแบคทีเรีย LIF และชั้นฟีดเดอร์ของเซลล์สโตรมาของทารกในครรภ์ถูกแยกออกจากอาหารเลี้ยงเชื้อ และสร้างเงื่อนไขสำหรับการแบ่งตัวของเซลล์ประสาทเป็นเซลล์ประสาทโดยใช้ไซโตไคน์และปัจจัยการเจริญเติบโตร่วมกัน จากนั้นเซลล์ประสาทจะถูกทำให้บริสุทธิ์จากเซลล์เทอราโตคาร์ซิโนมาที่ไม่โตเต็มที่บนเครื่องคัดแยกเซลล์แบบไหล หลังจากทำการฟอกเลือดขั้นที่สองและกำหนดลักษณะทางฟีโนไทป์ของเซลล์ที่ปลูกถ่ายแล้ว เซลล์ประสาทที่ถูกแขวนลอย (10-12 ล้านเซลล์) จะถูกฉีดเข้าไปในนิวเคลียสฐานของสมองของผู้ป่วย (ในเดือนที่ 7 หลังจากโรคหลอดเลือดสมองแตก) โดยใช้ไมโครแคนนูลาและเข็มฉีดยาพิเศษภายใต้การควบคุมด้วยการถ่ายภาพสามมิติและคอมพิวเตอร์โทโมกราฟี การคัดกรองผลที่ตามมาของการปลูกถ่ายเซลล์ประสาทในบริเวณที่เกิดโรคหลอดเลือดสมองเป็นเวลา 1 ปีหลังการปลูกถ่ายไม่พบผลข้างเคียงหรือผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์ใดๆ ผู้ป่วยครึ่งหนึ่งมีการทำงานของระบบการเคลื่อนไหวที่ดีขึ้นในช่วง 6 ถึง 12 เดือนหลังการปลูกถ่าย การเปลี่ยนแปลงทางคลินิกในเชิงบวกมาพร้อมกับการไหลเวียนของเลือดไปยังบริเวณที่เกิดโรคหลอดเลือดสมองที่เพิ่มขึ้นหลังจากการปลูกถ่ายเซลล์ โดยการดูดซึมของ 2-ดีออกซีกลูโคสที่ติดฉลากด้วยสารเรืองแสงเพิ่มขึ้นโดยเฉลี่ยตามการถ่ายภาพด้วยโพซิตรอนเอ็มมิชชันโทโมกราฟี อยู่ที่ 18% และในผู้ป่วยบางรายอยู่ที่ 35%

อย่างไรก็ตาม สถาบันสุขภาพแห่งชาติของสหรัฐอเมริกาได้ดำเนินการศึกษาวิจัยอิสระเกี่ยวกับประสิทธิผลทางคลินิกของการปลูกถ่ายเส้นประสาทในผู้ป่วยโรคพาร์กินสัน ผู้ป่วยในกลุ่มแรกได้รับการปลูกถ่ายด้วยเนื้อเยื่อประสาทของตัวอ่อนที่ผลิตโดปามีน ในขณะที่ผู้ป่วยกลุ่มที่สองได้รับการผ่าตัดหลอก ผลการศึกษาบ่งชี้ว่าการปลูกถ่ายเส้นประสาทดังกล่าวไม่มีประสิทธิผลทางคลินิก แม้ว่าเซลล์ประสาทของตัวอ่อนที่ผลิตโดปามีนจะยังคงอยู่ในสมองของผู้รับการปลูกถ่ายก็ตาม ยิ่งไปกว่านั้น 2 ปีหลังจากการปลูกถ่ายเนื้อเยื่อประสาทของตัวอ่อน ผู้ป่วย 15% เกิดอาการดิสคิเนเซียเรื้อรัง ซึ่งไม่มีในผู้ป่วยกลุ่มที่ได้รับยาหลอก (เซลล์ต้นกำเนิด: ความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์และทิศทางการวิจัยในอนาคต สถาบันสุขภาพแห่งชาติ สหรัฐอเมริกา) การสังเกตการพัฒนาเพิ่มเติมของโรคในผู้ป่วยเหล่านี้ยังคงดำเนินต่อไป

ผู้เขียนบางคนเชื่อมโยงข้อมูลวรรณกรรมที่ขัดแย้งกันเกี่ยวกับการประเมินประสิทธิผลทางคลินิกของการปลูกถ่ายประสาทกับแนวทางที่แตกต่างกันในการคัดเลือกกลุ่มผู้ป่วย การเลือกวิธีการที่ไม่เพียงพอในการประเมินภาวะของผู้ป่วยอย่างเป็นกลาง และที่สำคัญที่สุดคือ ช่วงเวลาที่แตกต่างกันของการพัฒนาของเนื้อเยื่อประสาทของตัวอ่อน และบริเวณต่างๆ ของสมองที่ได้เนื้อเยื่อนี้มา ขนาดการปลูกถ่ายที่แตกต่างกัน และคุณลักษณะเชิงวิธีการของการผ่าตัด

ควรสังเกตว่าความพยายามในการปลูกถ่ายเซลล์ต้นกำเนิดเอ็มบริโอที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงได้หลายแบบโดยตรงไปยังบริเวณสไตรเอตัมของสมองของหนูที่เป็นโรคพาร์กินสันแบบทดลองนั้นมาพร้อมกับการขยายตัวของเซลล์ต้นกำเนิดเอ็มบริโอและการแบ่งตัวของเซลล์ต้นกำเนิดเอ็มบริโอไปเป็นเซลล์ประสาทโดพามีน ควรสันนิษฐานว่าเซลล์ประสาทที่เพิ่งสร้างใหม่ได้รวมเข้ากับเครือข่ายประสาทอย่างมีประสิทธิภาพ เนื่องจากหลังจากการปลูกถ่ายเซลล์ต้นกำเนิดเอ็มบริโอแล้ว ได้มีการสังเกตการแก้ไขความผิดปกติทางพฤติกรรมและความไม่สมดุลของระบบสั่งการในการทดสอบอะโพมอร์ฟีน ในเวลาเดียวกัน สัตว์บางตัวก็ตายเนื่องจากเซลล์ต้นกำเนิดเอ็มบริโอที่ปลูกถ่ายไปเปลี่ยนเป็นเนื้องอกในสมอง

ผู้เชี่ยวชาญจากสถาบันการแพทย์แห่งชาติและสถาบันสุขภาพแห่งชาติของสหรัฐอเมริกา เชื่อว่าศักยภาพทางคลินิกของ ESC สมควรได้รับความสนใจอย่างจริงจังที่สุด แต่ยืนกรานว่าจำเป็นต้องมีการศึกษาคุณสมบัติ แนวโน้มของภาวะแทรกซ้อน และผลที่ตามมาในระยะยาวอย่างละเอียดในการทดลองกับแบบจำลองทางชีววิทยาที่เหมาะสมของโรคในมนุษย์ (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press.; Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA)

จากมุมมองนี้ การวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยาเปรียบเทียบของเทอราโทมาในการทดลองที่ได้จากการปลูกถ่ายสารแขวนลอย ESC เข้าไปในอัณฑะกับเทอราโทมาที่เกิดขึ้นจากการปลูกถ่ายเอ็มบริโอในระยะเริ่มต้นซึ่งมี ESC อยู่ด้วยนั้น แสดงให้เห็นว่า ESC ไม่ว่าจะมีแหล่งกำเนิดหรือปฏิสัมพันธ์กับเซลล์โดยรอบบางเซลล์ก็ตาม ก็มีศักยภาพในการก่อมะเร็งในลักษณะเดียวกัน ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเทอราโทมาดังกล่าวมีต้นกำเนิดแบบโคลน เนื่องจากเนื้องอกที่ประกอบด้วยอนุพันธ์ของชั้นเชื้อโรคทั้งสามชั้นสามารถเกิดขึ้นได้จาก ESC หนึ่งตัว (Rega, 2001) ที่น่าสังเกตก็คือ เมื่อปลูกถ่าย ESC ที่โคลนซึ่งมีแคริโอไทป์ปกติเข้าไปในหนูที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง เทอราโทมาก็ก่อตัวขึ้นด้วย โดยข้อมูลการทดลองเหล่านี้เป็นหลักฐานที่พิสูจน์ได้อย่างชัดเจนว่าเทอราโทมามีต้นกำเนิดแบบโคลน จากมุมมองของชีววิทยาการพัฒนา พบว่าเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพเพียงเซลล์เดียวไม่ได้ทำหน้าที่เป็นแหล่งของอนุพันธ์ที่แยกความแตกต่างของเซลล์ทั้งสามชั้นที่ประกอบเป็นเทอราโทมา อย่างไรก็ตาม ผลการศึกษาเหล่านี้ถือเป็นสัญญาณเตือนถึงอันตรายที่อาจเกิดขึ้นได้หากไม่ใช่การห้ามปรามในการปลูกถ่ายเซลล์จริง เนื่องจากการฉีดเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพหรือเซลล์เชื้อพันธุ์ดั้งเดิมเข้าไปในเนื้อเยื่อต่างๆ ของหนูโตเต็มวัยที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง ทำให้เกิดเนื้องอกจากเซลล์ต้นกำเนิดที่ปลูกถ่ายอย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้ การเสื่อมสภาพของเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพที่ปลูกถ่ายนอกสถานที่จะมาพร้อมกับการเกิดขึ้นของเซลล์ที่แยกความแตกต่างได้ในกลุ่มดาวเทียม ซึ่งเกิดจากการแยกความแตกต่างบางส่วนของเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพและโคลนของเซลล์ต้นกำเนิดเป็นสายพันธุ์เฉพาะ ที่น่าสนใจคือ เมื่อเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพถูกปลูกถ่ายเข้าไปในกล้ามเนื้อโครงร่าง เซลล์ประสาทมักจะก่อตัวขึ้นถัดจากเซลล์เทอราโทคาร์ซิโนมา อย่างไรก็ตาม การนำ ESC เข้าไปในไข่หรือบลาสโตซิสต์ที่กำลังแบ่งตัวจะมาพร้อมกับการผสานรวมของเซลล์เข้าไปในเอ็มบริโออย่างสมบูรณ์โดยไม่เกิดองค์ประกอบเนื้องอก ในกรณีนี้ ESC จะถูกผสานเข้ากับอวัยวะและเนื้อเยื่อเกือบทั้งหมดของเอ็มบริโอ รวมถึงอวัยวะสืบพันธุ์ด้วย สัตว์อัลโลฟีนดังกล่าวได้มาครั้งแรกโดยการนำเซลล์เทอราโตคาร์ซิโนมา 129 เข้าไปในเอ็มบริโอระยะแรกในระยะ 8-100 เซลล์ ในหนูอัลโลฟีน ประชากรของเซลล์ที่มีลักษณะแตกต่างกันซึ่งได้มาจาก ESC ของผู้บริจาคจะถูกผสานเข้ากับเนื้อเยื่อของไขกระดูก ลำไส้ ผิวหนัง ตับ และอวัยวะสืบพันธุ์ ซึ่งทำให้สามารถสร้างไคเมร่าเซลล์ข้ามสายพันธุ์ได้ในระหว่างการทดลอง ยิ่งระยะเวลาการพัฒนาของเอ็มบริโอระยะแรกสั้นเท่าไร เปอร์เซ็นต์ของไคเมร่าเซลล์ก็จะยิ่งสูงขึ้น โดยพบระดับไคเมร่าสูงสุดในระบบสร้างเม็ดเลือด ผิวหนัง ระบบประสาท ตับ และลำไส้เล็กของเอ็มบริโออัลโลฟีน ในสิ่งมีชีวิตที่โตเต็มวัย เนื้อเยื่อที่ได้รับการปกป้องจากระบบภูมิคุ้มกันของผู้รับโดยสิ่งกั้นทางฮิสโตฮีมาติกจะไวต่อการเกิดไคเมอไรเซชัน:การปลูกถ่ายเซลล์สืบพันธุ์หลักเข้าไปในเนื้ออัณฑะจะมาพร้อมกับการรวมเซลล์ต้นกำเนิดของผู้บริจาคเข้าไปในชั้นเนื้อเยื่อสืบพันธุ์ของผู้รับ อย่างไรก็ตาม เมื่อทำการปลูกถ่ายเซลล์สืบพันธุ์แบบอาศัยเพศเข้าไปในระยะบลาสโตซิสต์ การก่อตัวของเซลล์ต้นกำเนิดไคเมอริกของอวัยวะเพศพร้อมกับการสร้างเซลล์สืบพันธุ์หลักของผู้บริจาคจะไม่เกิดขึ้น ความสามารถในการสร้างเซลล์สืบพันธุ์แบบอาศัยเพศของ ESC เมื่อมีการสร้างเงื่อนไขพิเศษ สามารถใช้สำหรับการโคลนได้เช่นกัน การปลูกถ่ายเซลล์สืบพันธุ์แบบอาศัยเพศของหนูเข้าไปในเอ็มบริโอของหนูที่มี 8-16 เซลล์ ซึ่งการแบ่งเซลล์แบบไมโทซิสจะถูกบล็อกด้วยไซโตแคลซิน จะส่งเสริมให้เกิดการสร้างเอ็มบริโอตามปกติพร้อมกับการพัฒนาเอ็มบริโอจากเซลล์สืบพันธุ์แบบอาศัยเพศของผู้บริจาค

ดังนั้น ทางเลือกอื่นสำหรับการปลูกถ่าย ESC จากผู้อื่นคือการโคลนนิ่งเพื่อการรักษาโดยอาศัยการปลูกถ่ายนิวเคลียสของเซลล์ร่างกายเข้าไปในไข่ที่ลอกเปลือกออกเพื่อสร้างบลาสโตซิสต์ จากนั้นจึงแยกสาย ESC ที่มีพันธุกรรมเหมือนกับผู้บริจาคของนิวเคลียสเซลล์ร่างกายจากมวลเซลล์ด้านใน ในทางเทคนิค แนวคิดนี้ค่อนข้างเป็นไปได้ เนื่องจากความเป็นไปได้ในการสร้างสาย ESC จากบลาสโตซิสต์ที่ได้หลังจากการปลูกถ่ายนิวเคลียสเซลล์ร่างกายเข้าไปในไข่ที่ลอกเปลือกออกได้รับการพิสูจน์ซ้ำแล้วซ้ำเล่าในการทดลองกับสัตว์ทดลอง (Nagy, 1990; Munsie, 2000) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ในหนูที่มีการกลายพันธุ์ของยีน rag2 แบบโฮโมไซกัส ไฟโบรบลาสต์ที่ได้จากการเพาะเลี้ยงเซลล์เนื้อเยื่อใต้ผิวหนังจะถูกใช้เป็นผู้บริจาคของนิวเคลียส ซึ่งจะถูกปลูกถ่ายเข้าไปในโอโอไซต์ที่ลอกเปลือกออก หลังจากการกระตุ้นโอโอไซต์แล้ว "ไซโกต" จะถูกเพาะเลี้ยงจนกระทั่งเกิดการก่อตัวของบลาสโตซิสต์ ซึ่ง ESC จะถูกแยกออกจากมวลเซลล์ด้านในและถ่ายโอนไปยังสายเซลล์ที่ไม่ถูกสร้างใหม่สำหรับยีนกลายพันธุ์ (rag2~/~) การกลายพันธุ์ของยีนอัลลีลหนึ่งตัวได้รับการแก้ไขใน ESC ดังกล่าวด้วยวิธีการรวมตัวแบบโฮโมโลกัส ในชุดการทดลองแรก เอ็มบริออยด์บอดีจะได้รับจาก ESC ที่มียีนที่ฟื้นฟูด้วยรีคอมบิแนนท์ เซลล์ของเอ็มบริออยด์บอดีจะถูกถ่ายยีนรีคอมบิแนนท์เรโทรไวรัส (HoxB4i/GFP) และหลังจากการสืบพันธุ์ จะถูกฉีดเข้าในเส้นเลือดของหนู rag2~/~ ในชุดการทดลองที่สอง บลาสโตเมียร์ที่เป็นสี่เท่าจะถูกรวมเข้ากับ ESC ที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรม และปลูกถ่ายเข้าไปในตัวเมียที่เป็นผู้รับ หนูที่มีภูมิคุ้มกันปกติที่ได้จะทำหน้าที่เป็นผู้บริจาคไขกระดูกสำหรับการปลูกถ่ายเข้าไปในหนูกลายพันธุ์ rag2~/~ จากการทดลองทั้งสองชุดพบว่าผลลัพธ์เป็นบวก โดยพบว่าหลังจาก 3-4 สัปดาห์ เซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดไมอีลอยด์และลิมฟอยด์ปกติที่โตเต็มที่แล้วสามารถผลิตอิมมูโนโกลบูลินได้ในหนูทุกตัว ดังนั้น การปลูกถ่ายนิวเคลียสของเซลล์ร่างกายเข้าไปในโอโอไซต์จึงไม่เพียงแต่ใช้ในการรับเซลล์ ESC เท่านั้น แต่ยังใช้สำหรับไซโตเจโนเทอราพี ซึ่งเป็นการแก้ไขความผิดปกติทางพันธุกรรมโดยใช้ ESC เป็นพาหะในการขนส่งข้อมูลทางพันธุกรรมที่ถูกต้อง แต่การปลูกถ่ายเซลล์ในลักษณะนี้ นอกจากจะมีปัญหาทางชีวจริยธรรมแล้ว ยังมีข้อจำกัดอีกด้วย ยังไม่ชัดเจนว่าการปลูกถ่ายเซลล์โคลนเพื่อการรักษาที่มีจีโนไทป์เหมือนกับจีโนไทป์ของผู้ป่วยรายใดรายหนึ่งจะปลอดภัยเพียงใด เนื่องจากเซลล์ดังกล่าวอาจทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่ทำให้เกิดความเสี่ยงต่อโรคอื่นๆ ได้ ไข่มนุษย์ปกติยังคงเป็นวัตถุที่เข้าถึงได้ยาก ในขณะที่แม้จะปลูกถ่ายนิวเคลียสของเซลล์ร่างกายเข้าไปในไข่สัตว์ที่เอานิวเคลียสออกแล้ว ไซโกตที่สร้างขึ้นจะมีเพียง 15-25% เท่านั้นที่พัฒนาไปสู่ระยะบลาสโตซิสต์ ยังไม่มีการกำหนดว่าต้องใช้บลาสโตซิสต์กี่ตัวจึงจะได้เซลล์ ESC โคลนที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมหนึ่งสายพันธุ์ นอกจากนี้ ยังควรทราบด้วยว่ามีค่าใช้จ่ายทางการเงินจำนวนมากที่เกี่ยวข้องกับความซับซ้อนของวิธีการโคลนเพื่อการรักษา

โดยสรุป ควรสังเกตว่าใน ESC ความสามารถในการแบ่งตัวของจีโนมที่มี DNA ที่มีเมทิลต่ำจะรวมเข้ากับกิจกรรมเทโลเมอเรสที่สูงและช่วง C^ ที่สั้นของวงจรเซลล์ ซึ่งรับประกันการสืบพันธุ์ที่เข้มข้นและอาจไม่มีที่สิ้นสุด ซึ่งในระหว่างนั้น ESC จะคงชุดโครโมโซมแบบดิพลอยด์และชุดลักษณะทางฟีโนไทป์ "เยาว์วัย" การเจริญเติบโตแบบโคลนของ ESC ในวัฒนธรรมจะไม่รบกวนการแบ่งตัวเป็นสายเซลล์เฉพาะใดๆ ของสิ่งมีชีวิตเมื่อหยุดการแพร่พันธุ์และเพิ่มสัญญาณควบคุมที่เหมาะสม การแบ่งตัวแบบจำกัดของ ESC เป็นสายเซลล์โซมาติกในหลอดทดลองเกิดขึ้นได้โดยไม่มีการมีส่วนร่วมของเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน โดยหลีกเลี่ยง Nochteys นอกอวัยวะสร้างเซลล์ และไม่มีการสร้างตัวอ่อน การนำ ESC เข้าสู่ร่างกายโดยผิดที่นำไปสู่การสร้างเทอราโตคาร์ซิโนมาอย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้ การปลูกถ่าย ESC เข้าไปในระยะบลาสโตซิสต์หรือเอ็มบริโอระยะเริ่มต้นจะมาพร้อมกับการผสมผสานกับเนื้อเยื่อเอ็มบริโอและการสร้างไคเมอริเซชันของอวัยวะต่างๆ อย่างมีเสถียรภาพ

เทคโนโลยีการฟื้นฟูและฟื้นฟูเซลล์ที่อาศัยการปลูกถ่ายเซลล์เป็นจุดตัดของความสนใจของตัวแทนจากสาขาชีววิทยาของเซลล์ ชีววิทยาการพัฒนา พันธุศาสตร์เชิงทดลอง ภูมิคุ้มกันวิทยา ระบบประสาท โรคหัวใจ โลหิตวิทยา และสาขาอื่นๆ อีกมากมายของการแพทย์เชิงทดลองและการแพทย์เชิงปฏิบัติ ผลลัพธ์ที่สำคัญที่สุดของการศึกษาเชิงทดลองพิสูจน์ความเป็นไปได้ของการรีโปรแกรมเซลล์ต้นกำเนิดด้วยการเปลี่ยนแปลงคุณสมบัติที่กำหนดเป้าหมาย ซึ่งเปิดโอกาสให้ควบคุมกระบวนการของการแยกตัวของเซลล์โดยใช้ปัจจัยการเจริญเติบโตสำหรับการสร้างกล้ามเนื้อหัวใจใหม่ การฟื้นฟูรอยโรคในระบบประสาทส่วนกลาง และการทำให้การทำงานของอุปกรณ์เกาะของตับอ่อนเป็นปกติ อย่างไรก็ตาม เพื่อให้สามารถแนะนำการปลูกถ่ายอนุพันธ์ ESC เข้าสู่การแพทย์เชิงปฏิบัติอย่างแพร่หลาย จำเป็นต้องศึกษาคุณสมบัติของเซลล์ต้นกำเนิดของมนุษย์อย่างละเอียดมากขึ้นและทำการทดลองกับเซลล์ต้นกำเนิด ESC ในแบบจำลองโรคที่ทดลองต่อไป

ปัญหาทางชีวจริยธรรมและปัญหาการปฏิเสธการปลูกถ่ายเซลล์จากผู้อื่นอาจแก้ไขได้ด้วยการค้นพบความยืดหยุ่นของจีโนมของเซลล์ต้นกำเนิดในภูมิภาคของสิ่งมีชีวิตที่โตเต็มวัย อย่างไรก็ตาม ข้อมูลเบื้องต้นที่ระบุว่าเมื่อทำการปลูกถ่ายเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดอัตโนมัติที่แยกและมีลักษณะเฉพาะอย่างระมัดระวังเข้าไปในตับ ซึ่งเซลล์ตับใหม่จะถูกสร้างขึ้นและรวมเข้ากับกลีบตับนั้น กำลังได้รับการแก้ไขและวิพากษ์วิจารณ์อยู่ อย่างไรก็ตาม มีการเผยแพร่ข้อมูลว่าการปลูกถ่ายเซลล์ต้นกำเนิดของระบบประสาทเข้าไปในต่อมไทมัสทำให้เกิดการสร้างเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิด T และ B จากผู้บริจาคใหม่ และการปลูกถ่ายเซลล์ต้นกำเนิดของระบบประสาทในสมองเข้าไปในไขกระดูกจะนำไปสู่การสร้างเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดเม็ดเลือดที่มีการสร้างเม็ดเลือดจากผู้บริจาคในระยะยาวและการสร้างเม็ดเลือดแดงจากผู้บริจาค ดังนั้น เซลล์ต้นกำเนิดที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนรูปแบบจีโนมให้มีศักยภาพเท่ากับเซลล์ต้นกำเนิดของสิ่งมีชีวิตที่โตเต็มวัยสามารถคงอยู่ในอวัยวะของสิ่งมีชีวิตที่โตเต็มวัยได้

แหล่งที่มาของการได้รับ ESC เพื่อวัตถุประสงค์ทางการแพทย์ยังคงเป็นตัวอ่อนของมนุษย์ ซึ่งเป็นตัวกำหนดล่วงหน้าถึงความหลีกเลี่ยงไม่ได้ของจุดตัดใหม่ระหว่างประเด็นทางศีลธรรม จริยธรรม กฎหมาย และศาสนา ณ จุดกำเนิดของชีวิตมนุษย์ การค้นพบ ESC ได้เป็นแรงผลักดันอันทรงพลังในการกลับมาหารือกันอีกครั้งเกี่ยวกับเส้นแบ่งระหว่างเซลล์ที่มีชีวิตกับสสาร สิ่งมีชีวิตและบุคลิกภาพ ในขณะเดียวกัน ก็ไม่มีบรรทัดฐาน กฎเกณฑ์ และกฎหมายสากลเกี่ยวกับการใช้ ESC ในทางการแพทย์ แม้จะมีความพยายามหลายครั้งในการสร้างและนำมาใช้ก็ตาม แต่ละรัฐภายในกรอบกฎหมายของตนจะแก้ปัญหานี้ด้วยตนเอง สำหรับส่วนของตนเอง แพทย์ทั่วโลกยังคงพยายามใช้ยารักษาแบบฟื้นฟูเกินขอบเขตของการหารือดังกล่าว โดยส่วนใหญ่ใช้เซลล์ต้นกำเนิดของผู้ใหญ่สำรองแทนเซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อน

ประวัติย่อๆ ของการแยกเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน

เซลล์เทอราโต(เอ็มบริโอ)คาร์ซิโนมาถูกแยกจากเทอราโตมาของอัณฑะที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติของหนู 129/ter-Sv เทอราโตมาของรังไข่ที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติของหนู Lt/Sv และจากเทอราโตมาที่ได้จากเซลล์หรือเนื้อเยื่อเอ็มบริโอที่ปลูกถ่ายนอกสถานที่ ในบรรดาเซลล์เทอราโต(เอ็มบริโอ)คาร์ซิโนมาของหนูที่เสถียรซึ่งได้มาด้วยวิธีนี้ บางส่วนสามารถแบ่งตัวได้หลายแบบ บางส่วนสามารถแยกตัวได้เฉพาะประเภทเซลล์เฉพาะหนึ่งชนิด และบางส่วนไม่สามารถแยกตัวได้เลย

ในช่วงหนึ่ง มีการเน้นที่การศึกษาวิจัยที่มีผลบ่งชี้ถึงความเป็นไปได้ในการนำเซลล์มะเร็งเทอราโต (เอ็มบริโอ) กลับสู่ฟีโนไทป์ปกติหลังจากนำเซลล์ดังกล่าวเข้าไปในเนื้อเยื่อของเอ็มบริโอที่กำลังพัฒนา รวมถึงการทำงานเกี่ยวกับการสร้างเซลล์มะเร็งเทอราโต (เอ็มบริโอ) ที่ได้รับการดัดแปลงทางพันธุกรรมในหลอดทดลอง ซึ่งด้วยความช่วยเหลือดังกล่าว เราจึงได้หนูกลายพันธุ์มาเพื่อใช้ในการสร้างแบบจำลองทางชีววิทยาของพยาธิวิทยาทางพันธุกรรมในมนุษย์

การเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอยที่มีเงื่อนไขถูกนำมาใช้เพื่อแยกเซลล์มะเร็งเทอราโต-(เอ็มบริโอ)-คาร์ซิโนมา ในการเพาะเลี้ยง เซลล์มะเร็งเทอราโต-(เอ็มบริโอ)-คาร์ซิโนมา เช่น ESC จะเจริญเติบโตจนกลายเป็นเอ็มบริออยด์บอดี และต้องแยกตัวออกจากกันเพื่อถ่ายโอนสายพันธุ์ เพื่อรักษาความสามารถในการสร้างเซลล์ใหม่บนชั้นฟีดเดอร์ของไฟโบรบลาสต์เอ็มบริโอ หรือระหว่างการเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอยในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีเงื่อนไข เซลล์ของสายพันธุ์มะเร็งเทอราโต-(เอ็มบริโอ)-คาร์ซิโนมาที่มีศักยภาพในการสร้างเซลล์ใหม่มีขนาดใหญ่ เป็นทรงกลม มีลักษณะเฉพาะคือมีกิจกรรมฟอสฟาเตสอัลคาไลน์สูง ก่อตัวเป็นกลุ่มก้อน และสามารถแยกความแตกต่างได้หลายทิศทาง เมื่อนำเข้าสู่ระยะบลาสโตซิสต์ เซลล์เหล่านี้จะรวมตัวกับมอรูลา ซึ่งนำไปสู่การสร้างเอ็มบริโอไคเมอริก โดยมีอวัยวะและเนื้อเยื่อต่างๆ ที่มีอนุพันธ์ของเซลล์มะเร็งเทอราโต-(เอ็มบริโอ)-คาร์ซิโนมาอยู่ด้วย อย่างไรก็ตาม ตัวอ่อนไคเมอริคส่วนใหญ่จะตายในครรภ์ และในอวัยวะของไคเมอริคแรกเกิดที่รอดชีวิต เซลล์แปลกปลอมจะถูกตรวจพบได้ยากและมีความหนาแน่นต่ำ ในเวลาเดียวกัน อุบัติการณ์ของเนื้องอก (Fibrosarcoma, Rhabdomyosarcoma, เนื้องอกร้ายชนิดอื่นๆ และอะดีโนมาของตับอ่อน) จะเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว และมักเกิดการเสื่อมของเนื้องอกในช่วงที่ตัวอ่อนไคเมอริคพัฒนาในมดลูก

เซลล์มะเร็งเทอราโต-(เอ็มบริโอ) ส่วนใหญ่ในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเซลล์เอ็มบริโอปกติจะมีลักษณะมะเร็งร้ายโดยธรรมชาติ เชื่อกันว่ามะเร็งร้ายที่ไม่สามารถกลับคืนได้นั้นเกิดจากการกระตุ้นโปรโตออนโคยีนในกระบวนการปรับเปลี่ยนโครงสร้าง เซลล์มะเร็งเอ็มบริโอสายพันธุ์ SST3 ที่ได้จากเทอราโตมาของอัณฑะในหนู (สายพันธุ์ 129/Sv-ter) ถือเป็นข้อยกเว้น เซลล์มะเร็งเทอราโต-(เอ็มบริโอ) ในหนูไคเมอริกมีความสามารถในการแทรกซึมเข้าไปในเนื้อเยื่อและอวัยวะของเอ็มบริโอได้สูงโดยไม่ก่อให้เกิดเนื้องอกในภายหลัง อนุพันธ์ของเซลล์มะเร็งเทอราโต-(เอ็มบริโอ) ในหนูไคเมอริกแทบจะไม่ได้มีส่วนร่วมในการสร้างโกโนไซต์หลัก เห็นได้ชัดว่าสาเหตุมาจากความถี่สูงของความผิดปกติของโครโมโซมซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของสายพันธุ์ terato-(embryo)-carcinoma ส่วนใหญ่ โดยในเซลล์จะพบทั้งความผิดปกติของจำนวนโครโมโซมและความผิดปกติของโครโมโซม

เซลล์มะเร็งเทอราโต-(เอ็มบริโอ)ในมนุษย์หลายสายพันธุ์ที่เสถียรซึ่งมีลักษณะเฉพาะคือความสามารถในการแบ่งตัวได้หลายแบบ มีกิจกรรมการแบ่งตัวสูง และมีความสามารถในการแยกความแตกต่างระหว่างการเจริญเติบโตในวัฒนธรรม ได้รับจากสภาพห้องปฏิบัติการ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เซลล์มะเร็งเทอราโต-(เอ็มบริโอ)ในมนุษย์ NTERA-2 ถูกใช้เพื่อศึกษาเกี่ยวกับกลไกของการแยกความแตกต่างของเซลล์ประสาท หลังจากการปลูกถ่ายเซลล์ของสายพันธุ์นี้เข้าไปในบริเวณใต้โพรงสมองส่วนหน้าของหนูแรกเกิด ก็พบการย้ายถิ่นฐานและการสร้างเซลล์ประสาทของพวกมัน มีการพยายามปลูกถ่ายเซลล์ประสาทที่ได้จากการเพาะเลี้ยงเซลล์มะเร็งเทอราโต-(เอ็มบริโอ) NTERA-2 ให้กับผู้ป่วยโรคหลอดเลือดสมอง ซึ่งตามที่ผู้เขียนกล่าวไว้ เซลล์เหล่านี้ทำให้การดำเนินโรคทางคลินิกดีขึ้น ในขณะเดียวกัน ยังไม่มีกรณีของเซลล์มะเร็งเทอราโต-(เอ็มบริโอ) ที่ปลูกถ่าย NTERA-2 ในผู้ป่วยโรคหลอดเลือดสมอง

เซลล์ต้นกำเนิดเอ็มบริโอของหนูที่ยังไม่แยกความแตกต่างสายพันธุ์แรกได้รับในช่วงต้นทศวรรษ 1980 โดยเอแวนส์และมาร์ติน ซึ่งแยกเซลล์เหล่านี้จากเซลล์มวลภายในของระยะบลาสโตซิสต์ หรือเอ็มบริโอบลาสต์ เซลล์ ESC ที่แยกออกมาได้ยังคงความสามารถในการแยกความแตกต่างและความสามารถในการแยกความแตกต่างเป็นเซลล์ประเภทต่างๆ ภายใต้อิทธิพลของปัจจัยต่างๆ ในอาหารเลี้ยงเชื้อพิเศษเป็นเวลานาน

คำว่า "เซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพของตัวอ่อน" เป็นของ Leroy Stevens ซึ่งขณะศึกษาผลกระทบของน้ำมันดินยาสูบต่อการเกิดเนื้องอก ได้ให้ความสนใจกับการเกิดมะเร็งเทอราโทคาร์ซิโนมาของอัณฑะในหนูเชิงเส้น (129/v) ในกลุ่มควบคุม เซลล์ของมะเร็งเทอราโทคาร์ซิโนมาของอัณฑะมีลักษณะเฉพาะคือมีอัตราการแพร่พันธุ์สูง และเมื่อมีของเหลวจากช่องท้อง เซลล์เหล่านี้จะแยกตัวโดยธรรมชาติด้วยการสร้างเซลล์ประสาท เซลล์เคราติโนไซต์ เซลล์กระดูกอ่อน เซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ รวมถึงเส้นผมและกระดูก แต่ไม่มีสัญญาณใดๆ ของโครงสร้างเซลล์ที่เป็นระเบียบของเนื้อเยื่อที่เกี่ยวข้อง เมื่อนำมาเพาะเลี้ยง เซลล์เทอราโตคาร์ซิโนมาจะเติบโตเป็นโคลนที่มีศักยภาพในการแบ่งตัวหลายอย่างโดยไม่ยึดติดกับสารตั้งต้นและสร้างเป็นร่างของเอ็มบริออยด์ หลังจากนั้น เซลล์จะหยุดแบ่งตัวและเกิดการแบ่งตัวผิดปกติตามธรรมชาติเป็นเซลล์ประสาท เซลล์เกลีย เซลล์กล้ามเนื้อ และเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ สตีเวนส์พบว่าเทอราโตคาร์ซิโนมา 129/v ของหนูมีเซลล์ที่สามารถแบ่งตัวเป็นกลุ่มเซลล์โซมาติกเฉพาะทางได้น้อยกว่า 1% และการแบ่งตัวนั้นขึ้นอยู่กับปัจจัยที่ส่งผลต่อเซลล์เหล่านั้น (องค์ประกอบของของเหลวในช่องท้อง ผลิตภัณฑ์ของเซลล์ที่โตเต็มที่ หรือเนื้อเยื่อที่เติมลงในเพาะเลี้ยง) สมมติฐานของ Leroy Stevenson เกี่ยวกับการมีอยู่ของเซลล์ต้นกำเนิดเอ็มบริโอของสายพันธุ์เชื้อพันธุ์ในหมู่เซลล์เทอราโตคาร์ซิโนมาได้รับการยืนยันแล้ว: การระงับเซลล์เอ็มบริโอบลาสต์จากเอ็มบริโอก่อนการฝังตัวในเนื้อเยื่อของหนูโตเต็มวัยก่อให้เกิดเทอราโตคาร์ซิโนมา และเซลล์บริสุทธิ์ที่แยกออกจากเซลล์เหล่านี้หลังจากการให้ทางช่องท้องแก่สัตว์รับที่แยกความแตกต่างเป็นเซลล์ประสาท เซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ และเซลล์โซมาติกอื่นๆ ที่ได้มาจากชั้นเชื้อพันธุ์ทั้งสามชั้น ในการทดลองในร่างกาย การปลูกถ่ายเซลล์ต้นกำเนิดเอ็มบริโอ (ที่ได้รับจากเอ็มบริโอบลาสต์แต่ไม่ใช่จากโทรโฟบลาสต์) เข้าไปในเอ็มบริโอของหนูสายพันธุ์อื่นที่ระยะบลาสโตเมียร์ 8-32 ส่งผลให้เกิดสัตว์ไคเมอริก (โดยไม่มีการพัฒนาของเนื้องอก) ในอวัยวะของสัตว์เหล่านี้มีเนื้อเยื่อของผู้บริจาคงอกออกมา สังเกตพบไคเมอริกแม้ในสายพันธุ์เซลล์เชื้อพันธุ์

เซลล์เชื้อพันธุ์ต้นกำเนิดหลักที่แยกจากเซลล์ต้นกำเนิดของอวัยวะสืบพันธุ์ของตัวอ่อนของหนูมีรูปร่าง ฟีโนไทป์ทางภูมิคุ้มกัน และลักษณะการทำงานที่สอดคล้องกับเซลล์ต้นกำเนิดของอวัยวะสืบพันธุ์ที่สตีเวนสันได้รับจากเทอราโตคาร์ซิโนมาและเอ็มบริโอบลาสต์ ในไคเมร่าที่เกิดหลังจากนำเซลล์ต้นกำเนิดของอวัยวะสืบพันธุ์เข้าสู่ระยะบลาสโตซิสต์ การสร้างรูปร่างของอวัยวะสืบพันธุ์แบบอัลโลฟีนจะมีลักษณะเฉพาะโดยการสลับกันแบบโมเสกของหน่วยโครงสร้างและการทำงานของตับ ปอด และไตของผู้บริจาคและผู้รับ ในบางกรณี ได้มีการสังเกตการก่อตัวของช่องลำไส้หรือกลีบตับที่ประกอบด้วยทั้งเซลล์ของผู้รับและผู้บริจาค อย่างไรก็ตาม การสร้างรูปร่างจะเกิดขึ้นตามโปรแกรมทางพันธุกรรมของสปีชีส์ที่ผู้รับเป็นสมาชิกเสมอ และไคเมร่าจะจำกัดอยู่เฉพาะในระดับเซลล์เท่านั้น

จากนั้นจึงได้มีการพิสูจน์ว่าเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน (ESC) แพร่กระจายโดยไม่มีการแบ่งตัวของเซลล์บนชั้นฟีดเดอร์ของเซลล์ที่ได้จากเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน (ไฟโบรบลาสต์ของทารกในครรภ์) โดยเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนจะต้องอยู่ในอาหารเลี้ยงเชื้อแบบเลือกสรร ซึ่งจะช่วยให้เซลล์ต้นกำเนิดและเซลล์ต้นกำเนิดสามารถอยู่รอดได้เฉพาะเซลล์ต้นกำเนิดเท่านั้น ในขณะที่เซลล์ต้นกำเนิดเฉพาะทางส่วนใหญ่จะตายไป โดยใช้วิธีการดังกล่าว ในปี 1998 เจมส์ ทอมสันได้แยกเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนที่เป็นอมตะจำนวน 5 สายพันธุ์จากมวลเซลล์ด้านในของระยะบลาสโตซิสต์ของมนุษย์ ในปีเดียวกันนั้น จอห์น เกอร์ฮาร์ตได้พัฒนาวิธีการแยกเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนที่เป็นอมตะจากตุ่มอวัยวะสืบพันธุ์ของตัวอ่อนมนุษย์อายุ 4-5 สัปดาห์ เนื่องจากคุณสมบัติเฉพาะตัวของเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนและเซลล์ต้นกำเนิดของเนื้อเยื่อเฉพาะตัวเพียง 2 ปีต่อมา จึงเริ่มมีการใช้เซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนและเซลล์ต้นกำเนิดของเนื้อเยื่อเฉพาะตัวในการแพทย์ฟื้นฟูและยีนบำบัด