หนึ่งขวด สองเป้าหมาย: การวินิจฉัยวัณโรคแบบพกพาโดยใช้ CRISPR ที่มีความไว 100%

บทความวิจัยเกี่ยวกับชุดตรวจวัณโรคแบบพกพาที่สามารถทำได้โดยตรงจากเสมหะ โดยไม่ต้องใช้อุปกรณ์ที่ซับซ้อน ได้รับการตีพิมพ์ในวารสารScience Advancesการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอแบบไอโซเทอร์มอลและการอ่านค่า CRISPR ถูกรวมไว้ในหลอดทดลองเดียว ทดสอบการแทรกเชื้อ M. tuberculosis แบบอนุรักษ์นิยมสองชุด (IS6110 และ IS1081) พร้อมกัน พร้อมกับยีนของมนุษย์เป็นตัวควบคุมภายในตัวอย่าง ในการทดสอบแบบ “ปิดบัง” ขนาดเล็กในตัวอย่างทางคลินิก การทดสอบให้ความไว 100% (6/6) และความจำเพาะ 100% (7/7) เมื่อเทียบกับการเพาะเชื้อ ขีดจำกัดการตรวจวัดอยู่ที่ประมาณ 69–81 CFU/ml ในเสมหะจำลอง สามารถดูผลลัพธ์ได้บนแถบทดสอบกระดาษ และน้ำยาจะถูกทำให้แห้งแบบแห้ง (การเก็บรักษาโดยไม่ใช้ “ห่วงโซ่ความเย็น”)

พื้นหลัง

องค์การอนามัยโลก (WHO) ระบุว่าวัณโรคจะคร่าชีวิตผู้คนประมาณ 1.25 ล้านคนในปี พ.ศ. 2566 และวัณโรคได้กลายเป็นสาเหตุการเสียชีวิตจากการติดเชื้ออันดับต้นๆ อีกครั้ง โดยมีผู้ป่วยประมาณ 10.8 ล้านราย ซึ่งทำให้การวินิจฉัยโรคที่เข้าถึงได้และรวดเร็วเป็นสิ่งสำคัญ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในพื้นที่ที่มีทรัพยากรจำกัด

• การทดสอบในปัจจุบันเป็นการผสมผสานระหว่างความแม่นยำ ความเร็ว และราคาการเพาะเชื้อแบบ “มาตรฐานทองคำ” มีความแม่นยำมากแต่ช้า กล้องจุลทรรศน์มีความเร็วแต่ไม่ไวต่อแสง แพลตฟอร์ม PCR เช่น Xpert MTB/RIF Ultra มีความไวสูงกว่ามาก (LOD ≈ 15.6 CFU/ml) แต่ต้องใช้อุปกรณ์และตลับเพาะเชื้อที่มีราคาแพง ทำให้ครอบคลุมพื้นที่จำกัด
• เหตุใดจึงต้องใช้ไอโซเทอร์มอลและ CRISPRการขยายสัญญาณ RPA แบบไอโซเทอร์มอลทำงานที่อุณหภูมิ 37–42 องศาเซลเซียส และไม่จำเป็นต้องใช้วงจรควบคุมอุณหภูมิ ซึ่งสะดวก "ในภาคสนาม" การอ่านค่า CRISPR (Cas12/13) เพิ่มความจำเพาะของสปีชีส์ และช่วยให้มองเห็นการไหลด้านข้าง ("แถบ") โดยไม่ต้องใช้เลนส์ที่ซับซ้อน โดยรวมแล้ว นี่คือเส้นทางสู่ชุดทดสอบ PVR แบบพกพาและราคาประหยัด
• เหตุใดจึงต้องใช้เป้าหมาย MBT สองเป้าหมายพร้อมกัน (IS6110 + IS1081) IS6110 เป็นชุดแทรกหลายชุดของ คอมเพล็กซ์ M. tuberculosisแต่บางสายพันธุ์มีชุดแทรกเพียงไม่กี่ชุด และการทดสอบ IS6110 เพียงอย่างเดียวอาจ "พลาด" การเพิ่มชุดแทรก IS1081 ชุดที่สองจะช่วยลดความเสี่ยงของผลลบลวง
• เหตุใดการควบคุมภายในของมนุษย์ตัวอย่างลมหายใจอาจมีสารยับยั้งและตัวอย่างที่ "ไม่ดี" การควบคุมภายในของมนุษย์ (เช่น RNase P/ดีเอ็นเอจีโนม) ยืนยันว่าวัสดุมีเพียงพอและปฏิกิริยาไม่ถูกยับยั้ง มิฉะนั้นผลลัพธ์จะไม่ถือว่าเป็นลบ
• รูปแบบหนึ่งหม้อมีความสำคัญในตัวมันเองช่วยลดขั้นตอน ลดความเสี่ยงของการปนเปื้อน และอำนวยความสะดวกในการทำงานนอกห้องปฏิบัติการ วิธีการดังกล่าวสำหรับวัณโรคได้แสดงให้เห็นถึงความเป็นไปได้แล้ว งานวิจัยใหม่นี้ได้ขยายแนวคิดนี้ไปสู่รูปแบบเป้าหมายคู่พร้อมระบบควบคุมภายใน พร้อมสาธิตการทำแห้งเยือกแข็งของรีเอเจนต์และเครื่องอ่านแถบ
• บทความปัจจุบันมีคุณค่าอย่างไรผู้เขียนได้สาธิตการตรวจจับโดยตรงจากเสมหะหลังจากการเตรียมตัวอย่างที่ง่ายที่สุด ขีดจำกัดการตรวจจับที่ ~70–80 CFU/ml ในเสมหะจำลอง และความไว/ความจำเพาะ 100% บนชุดตัวอย่างทางคลินิกขนาดเล็กแบบปิดตา ซึ่งเป็น "การสาธิตทางเทคนิค" ที่ดีสำหรับการตรวจสอบความถูกต้องจากหลายศูนย์เพิ่มเติม

มันทำงานอย่างไร

• นักวิทยาศาสตร์ได้รวม RPA (การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมแบบไอโซเทอร์มอลอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส) เข้ากับเอนไซม์ "ตัด" Cas13a/Cas12a หลังจากเลือก RNA นำทางแล้ว พวกเขาได้กำหนดค่าระบบให้กำหนดเป้าหมาย MBT สองเป้าหมายพร้อมกัน และขนานไปกับ DNA ของมนุษย์ (โดยตรวจสอบว่ามีสารพันธุกรรมอยู่ในตัวอย่างหรือไม่ และปฏิกิริยายังไม่ "หยุดชะงัก")
• สารเคมีทั้งหมดถูกใส่ไว้ในหลอดทดลองหนึ่งหลอด หลังจากการฟักตัวแล้ว ผลลัพธ์จะถูกอ่านด้วยเครื่องฟลูออไรต์หรือแถบทดสอบการไหลข้าง - โดยพื้นฐานแล้วเหมือนกับการทดสอบแบบด่วน
• การประมวลผลเสมหะได้รับการทำให้ง่ายขึ้นด้วยการให้ความร้อนและการปั่นเหวี่ยงระยะสั้น โดยไม่ต้องใช้เครื่องสกัดกรดนิวคลีอิก สำหรับเงื่อนไขที่จำกัดที่สุด ผู้เขียนยังได้อภิปรายถึงทางเลือกอื่นนอกเหนือจากการปั่นเหวี่ยงด้วย

ผลการทดสอบแสดงให้เห็นอะไรบ้าง

• ขีดจำกัดการตรวจพบ: 69.0 CFU/มล. (สายพันธุ์ H37Rv) และ 80.5 CFU/มล. (BCG) ในเสมหะ "พุ่งสูง" ไม่พบปฏิกิริยาข้ามสายพันธุ์กับแบคทีเรีย/เชื้อราชนิดอื่น
• การทดลองทางคลินิก (ตัวอย่างที่ปกปิด): จากตัวอย่าง 13 ตัวอย่างจากการปฏิบัติจริง - มีความไว 100% (6/6) และความจำเพาะ 100% (7/7) เมื่อเทียบกับการเพาะเชื้อ สำหรับการเปรียบเทียบ GeneXpert Ultra ในชุดเดียวกันนี้แสดงค่า 100%/86% ตามลำดับ
• รายละเอียดทางเทคนิค: จากตัวเลือกการอ่านสองแบบ Cas13a ทำงานได้ดีกว่า (สำหรับรูปแบบ "one-pot" จะมีความไวมากกว่า Cas12a) นอกจากนี้ การทดสอบแบบคู่ขนานกับเป้าหมาย Mtb สองเป้าหมายยังช่วยลดความเสี่ยงที่จะเกิดผลลัพธ์ที่ผิดพลาด

เหตุใดจึงจำเป็นเช่นนี้?

การทดสอบในปัจจุบันเป็นการผสมผสานระหว่างความแม่นยำ ความเร็ว และความพร้อมใช้งาน: การเพาะเชื้อมีความแม่นยำมากแต่ช้า การสวอปให้ผลรวดเร็วแต่ไม่แม่นยำ ระบบ PCR เช่น GeneXpert มีความแม่นยำและรวดเร็วแต่ต้องใช้เครื่องมือและตลับหมึกที่มีราคาแพง แนวทาง CRISPR ใหม่นี้มุ่งเป้าไปที่การลดช่องว่างดังกล่าว: การวินิจฉัยภาคสนามที่ทำงานที่อุณหภูมิ 37°C พร้อมการอ่านค่าด้วยแถบกระดาษ และมีศักยภาพในการเก็บรักษาสารทดสอบโดยไม่ต้องแช่เย็น

ข้อจำกัดและสิ่งที่จะเกิดขึ้นต่อไป

นี่คือการสาธิตเบื้องต้นในชุดตรวจทางคลินิกขนาดเล็ก ซึ่งจำเป็นต้องมีการทดสอบขนาดใหญ่หลายศูนย์ (รวมถึงการติดเชื้อเอชไอวีร่วมด้วย ในเด็ก ที่มีรูปแบบเชื้อจุลินทรีย์ขนาดเล็ก และสาย MBT ที่แตกต่างกัน) ผู้เขียนระบุแยกต่างหากว่าในรุ่น "ภาคสนาม" เอง เครื่องปั่นเหวี่ยงแบบตั้งโต๊ะจะต้องถูกแทนที่ด้วยสารละลายแบบใช้มือทั้งหมด แต่โครงสร้างภายใน - "สองเป้าหมาย + การควบคุมภายใน" ในหลอดทดลองเดียว - ได้พิสูจน์แล้วว่าใช้งานได้จริง และมอบเส้นทางที่ชัดเจนสู่การปรับปรุงสำหรับการใช้งานจำนวนมาก

ที่มา: Alexandra G. Bell และคณะการทดสอบแบบ CRISPR ที่มีประสิทธิภาพสำหรับการตรวจหาวัณโรคโดยตรงจากเสมหะ Science Advances ออนไลน์ 6 สิงหาคม 2568 (เล่มที่ 11, ฉบับที่ 32) DOI: 10.1126/sciadv.adx206