งานวิจัยเชิงทดลองเกี่ยวกับการปลูกถ่ายเซลล์เคอราติโนไซต์จากต่างพันธุ์ลงบนแผลเป็นที่สร้างขึ้นโดยเทียมในหนูขาว

ความปรารถนาที่จะใช้ศักยภาพของเซลล์และความจำเป็นในการค้นหาวิธีการใหม่ๆ ที่มีประสิทธิภาพในการปรับปรุงรูปลักษณ์ที่สวยงามของรอยแผลเป็นทำให้เกิดแนวคิดในการพยายามศึกษาความเป็นไปได้ของการปลูกถ่ายเซลล์เคราติโนไซต์ลงบนพื้นผิวแผลเป็น

เพื่อพิสูจน์ความน่าจะเป็นในการใช้การเพาะเลี้ยงเซลล์เคอราติโนไซต์เพื่อปรับปรุงลักษณะของแผลเป็น ได้มีการศึกษาทดลองกับหนูทดลองสีขาว ซึ่งสร้างพื้นผิวแผลเป็นขึ้นมา แบบจำลองแผลเป็นของหนูได้รับมาจากการรักษาบาดแผลที่บาดเจ็บโดยเทียมที่หลังตามแนวกระดูกสันหลัง หนูถูกตัดผิวหนังเป็นชิ้นเดียวกันขนาด 2x3 ซม. 2.5 เดือนหลังจากการผ่าตัด "สร้างแบบจำลองแผลเป็น" หนูได้รับการขัดผิวด้วยเครื่อง Dermabrasion (การขจัดชั้นบนของแผลเป็นโดยใช้เทอร์โมคอสติก) และปลูกถ่ายเซลล์เคอราติโนไซต์จากแม่ โดยแยกจากผิวหนังของลูกหนู 2-4 วันหลังคลอด

การแยกและเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิวของหนูดำเนินการในห้องปฏิบัติการเทคโนโลยีเซลล์ของสถาบันเซลล์วิทยาของสถาบันวิทยาศาสตร์รัสเซียโดยใช้เทคโนโลยีต่อไปนี้

ผิวหนังถูกชะล้างด้วยสารละลายเกลือ Hank's ที่มีเจนตามัยซิน 200 หน่วยต่อมิลลิลิตร และหั่นเป็นชิ้นเล็ก ๆ พื้นที่ 0.2-0.5 ซม.2 ชิ้น^ส่วนผิวหนังถูกฟักในสารละลาย dispase 0.5% ในสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟตเกลือที่สมดุลที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นจึงย้ายชิ้นส่วนเหล่านี้ไปยังสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟตของ Dulbecco และแยกหนังกำพร้าออกจากหนังแท้ หนังกำพร้าถูกฟักในสารละลายทริปซิน 0.125% เป็นเวลา 10-15 นาทีโดยคนด้วยความเร็ว 50 รอบต่อนาที หลังจากนั้นหยุดการทำงานของเอนไซม์โดยเติมเซรั่มโคตัวอ่อน 5% เซลล์ที่แขวนลอยได้หนึ่งในสามส่วนถูกนำไปใช้ในรูปบริสุทธิ์สำหรับตัวเลือกหนึ่งในการปลูกถ่ายลงบนแผลเป็น ส่วนที่สามส่วนที่สองถูกปลูกบนฟิล์มเคลือบในบ้านที่เข้ากันได้ทางชีวภาพ "Polypor" และส่วนที่สาม - บนจานเพาะเชื้อที่ไม่มีสารตั้งต้น การผ่าตัดกรอผิวบริเวณรอยแผลเป็นที่เกิดขึ้นในหนู พร้อมกับการปลูกถ่ายเซลล์ผิวหนังของหนูลงไปบนแผลนั้น ดำเนินการภายใต้การดมยาสลบด้วยอีเธอร์และการจี้ด้วยความร้อน

ในกลุ่มหนูกลุ่มแรก หลังจากการขัดผิวด้วยเครื่อง Dermabrasion แล้ว ให้วางชิ้นส่วนของเนื้อเยื่อแคมบริกที่ผ่านการฆ่าเชื้อบนแผลเป็นที่ขัดแล้ว ล้างด้วยสารละลายทางสรีรวิทยา และเช็ดให้แห้ง จากนั้นจึงนำเซลล์ผิวหนังของหนูที่มาจากเซลล์อื่นมาเขย่าในความเข้มข้น 1.5 ล้านเซลล์ต่อ 1 มล. (ตามข้อมูลของ Institute of Cytology) จากนั้นวางชิ้นส่วนของเนื้อเยื่อแคมบริกบนแผลเป็นที่ขัดแล้วเพื่อให้เซลล์อยู่บนพื้นผิวของแผลเป็น จากนั้นจึงวางผ้าพันแผลหลายชั้นทับไว้ด้านบน แล้วเย็บติดกับขอบแผลเป็น

ส่วนหนึ่งของเซลล์ที่แขวนลอยได้นั้นถูกเพาะในจานเพาะเชื้อบนฟิล์ม Polypore ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วซึ่งตัดให้เป็นรูปร่างของจาน ส่วนอีกส่วนหนึ่งจะเพาะบนจานเพาะเชื้อที่ไม่มีฟิล์ม การเพาะเลี้ยงจะดำเนินการในอาหารเลี้ยงเชื้อ FAD ซึ่งประกอบด้วยส่วนผสมของ DMEM และอาหารเลี้ยงเชื้อ F12 ในอัตราส่วน 3:1 โดยเติมเซรั่มโคทารก 10% อินซูลิน 5 μg / ml (Sigma) ไฮโดรคอร์ติโซนเฮมิซักซิเนต 0.5 μg / ml (Sigma) ปัจจัยการเจริญเติบโตของผิวหนัง EGF 10 μg / ml (สถาบันเซลล์วิทยา RAS, เซนต์ปีเตอร์สเบิร์ก) หนูกลุ่มที่สองและสาม กลุ่มละ 7 ตัว ได้รับการผ่าตัด 6 วันหลังจากกลุ่มแรก เมื่อถึงเวลานี้ ชั้นหลายชั้นจะถูกสร้างขึ้นจากการแขวนลอยของเคอราติโนไซต์ที่เพาะในจานเพาะเชื้อ ซึ่งจะถูกปลูกถ่ายเข้าไปในหนู กลุ่มที่สองถูกปลูกถ่ายด้วยเอพิเดอร์มาไซต์บนฟิล์ม กลุ่มที่สาม - ด้วยชั้นหลายชั้นโดยไม่มีสารตั้งต้น หลังจากผ่านไป 7 วัน ชั้นหลายชั้นของเคอราติโนไซต์อัลโลจีเนอิก (MPALK) ที่ได้ ซึ่งเพาะบนแผ่นฟิล์ม "โพลีพอร์" จะถูกย้ายไปยังพื้นผิวแผลโดยตรง ด้านบน แผ่นฟิล์มจะถูกปิดด้วยผ้าพันแผลหลายชั้นเพื่อป้องกันการฉีกขาด และเย็บติดกับผิวหนังของหนู

ก่อนจะย้ายเซลล์เคราติโนไซต์ไปยังหนูกลุ่มที่สามที่เติบโตโดยไม่มีสารตั้งต้น PAC จะถูกแยกออกจากก้นจานเพาะเชื้อโดยการใช้สารกระจายตัว ซึ่งสารดังกล่าวสามารถทำลายพันธะระหว่างชั้นผิวหนังกับชั้นหนังกำพร้าได้อย่างเลือกสรร เมื่อสารกระจายตัวทำปฏิกิริยากับชั้นหลายชั้น สารกระจายตัวจะทำลายการเชื่อมต่อระหว่างเซลล์ในชั้นฐานกับก้นจานเพาะเชื้อ และส่งผลต่อการเชื่อมต่อระหว่างเซลล์น้อยกว่ามาก ซึ่งทำให้สามารถ "กำจัด" ชั้นนั้นได้ทั้งหมด การแยกชั้นเซลล์หลายชั้นที่มีสารกระจายตัวดำเนินการดังต่อไปนี้ ระบายตัวกลางการขนส่งออกจากจานเพาะเชื้อ ล้างชั้นเซลล์สามครั้งด้วยสารอาหารที่มียาปฏิชีวนะ โดยเฉพาะเจนตามัยซิน (0.2 มก./มล.) ชั้นหลายชั้นถูกเติมด้วยสารละลายสารกระจายตัว 0.125% (“ซิกม่า”) และวางไว้ในเทอร์โมสตัท โดยฟักที่อุณหภูมิ t=37°C เป็นเวลา 20-30 นาที การปรากฏของขอบสีขาวที่ลอกออกตามขอบของชั้นเป็นสัญญาณของการเริ่มต้นของกระบวนการแยกตัวออกจากขอบและด้านล่างของจานเพาะเชื้อ ไม่กี่นาทีหลังจากเริ่มกระบวนการแยกตัว สารละลาย dispase จะถูกระบายออก ชั้นของเยื่อบุผิวจะถูกล้างด้วยตัวกลาง 2-3 ครั้ง แผ่นปิดแผลปลอดเชื้อ "Lita-color" ที่ตัดเป็นขนาดถ้วยถูกนำไปทาบนพื้นผิวของชั้นหนังกำพร้า จากนั้นชั้นที่แยกออกด้วย dispase ซึ่งลอกออกจากด้านล่างของถ้วยด้วยไม้พายจะถูกติดไว้ โดยใช้แหนบตา ชั้นพร้อมกับสารเคลือบของผ้าเช็ดปาก "Lita-color" (รัสเซีย) ถูกฉีกออกจากด้านล่างของจานเพาะเชื้อและย้ายอย่างระมัดระวังไปยังพื้นผิวของแผลเป็นที่เตรียมไว้ ผ้าเช็ดปาก "Lita-color" ประกอบด้วยเจนตามัยซินและเอ็กโซลิน (สารสกัดจากคอลลาเจน) ซึ่งเมื่อชุบด้วยวัสดุเพาะที่เหลือแล้วด้วยสารละลายทางสรีรวิทยา จะพองตัวและกลายเป็นแผ่นปิดแผลสมัยใหม่ที่ช่วยปกป้องจากการติดเชื้อจากภายนอกได้ดี และรักษาได้เร็วเนื่องจากมีโครงสร้างที่ดูดซับความชื้น

ผ้าพันแผลหลายชั้นถูกนำไปใช้กับฟิล์ม Polypore และผ้าเช็ดปากสี Lita และเย็บติดกับผิวหนังของหนูเพื่อให้ตรึงได้แน่นขึ้น หนูแต่ละตัวถูกวางไว้ในกรงแยกกันเพื่อสร้างเงื่อนไขที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการบำรุงรักษาและการปลูกถ่ายเซลล์เคราตินที่ปลูกถ่าย ผ้าพันแผลของหนูที่ปลูกถ่ายสารแขวนลอยและชั้นเอพิเดอร์มาไซต์หลายชั้นโดยการกำจัดเซลล์ออกจะถูกทำให้ชื้นด้วยน้ำเกลือฆ่าเชื้อหลายครั้งต่อวันเพื่อสร้างเงื่อนไขที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการปลูกถ่ายเซลล์ เมื่อพิจารณาว่าฟิล์ม Polypore ไม่สามารถซึมน้ำได้ ผ้าพันแผลของหนูในกลุ่มที่สองจะไม่เปียก ซึ่งเป็นข้อดีอย่างหนึ่งเมื่อเทียบกับการปลูกถ่ายโดยไม่ใช้ฟิล์ม ผ้าพันแผลจะถูกถอดออกหลังจาก 10 วัน ภาพทางคลินิกของแผลเป็นหลังการปลูกถ่ายเซลล์นั้นแตกต่างจากแผลเป็นที่ไม่ได้ปลูกถ่ายเพียงเล็กน้อย ยกเว้นสีชมพูที่มากขึ้น (เนื่องจากการขัดผิว) และมีการลอกมากขึ้น ข้อเท็จจริงนี้ชี้ให้เห็นว่า ซึ่งทันทีหลังจากแผ่นปิดแผลหลุดออกด้วย MPC ไม่มีการเปลี่ยนแปลงใดๆ เกิดขึ้นกับแผลเป็น

การนำวัสดุชิ้นเนื้อจากหนูมาตรวจ

หลังจากการปลูกถ่ายเซลล์เคอราติโนไซต์จากพันธุกรรมของหนูลงบนแผลเป็นขัดเงาของหนูขาวเป็นเวลา 1, 2, 5 และ 9 เดือน วัสดุจะถูกนำไปตรวจทางจุลกายวิภาค ไซโทมอร์โฟโลยี และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน ตัวอย่างผิวหนังของหนูปกติและแผลเป็นที่ไม่ได้ปลูกถ่ายเซลล์จะถูกเก็บเป็นตัวควบคุม การวางยาสลบหนูทำโดยใช้ยาสลบอีเธอร์

หลังจากวางยาสลบแล้ว ชิ้นส่วนเนื้อเยื่อแผลเป็นจะถูกนำออกจากบริเวณที่ทำเครื่องหมายไว้ซึ่งจะปลูกถ่ายเซลล์เคราติโนไซต์โดยใช้เครื่องเจาะชิ้นเนื้อขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 2 มม. แล้วนำไปวางในสารละลายกลูตารัลดีไฮด์ 2.5% เพื่อเตรียมวัสดุสำหรับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน ชิ้นส่วนเนื้อเยื่อที่นำมาตรวจสอบทางจุลพยาธิวิทยาจะถูกนำไปวางในสารละลายฟอร์มาลินที่เป็นกลาง 10% จากนั้นจึงนำไปผ่านแอลกอฮอล์และฝังในพาราฟิน ตามด้วยการตัดส่วนที่บางมากและดูในกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง

การควบคุม I. ผิวหนังหนูปกติ

เพื่อดูความแตกต่างระหว่างภาพจุลทรรศน์ของผิวหนังหนูที่เป็นแผลเป็นปกติและแผลเป็นในบางครั้งหลังการปลูกถ่าย MPC จึงมีการแสดงภาพถ่ายและคำอธิบายในทุกขั้นตอนของการศึกษาครั้งนี้

หนังกำพร้าของผิวหนังปกติประกอบด้วยเซลล์ 7-9 ชั้น ชั้นหนังกำพร้ามีความหนาปานกลาง ในบางพื้นที่ประกอบด้วยชั้นของเกล็ดขน 6-8 ชั้น ชั้นฐานแสดงโดยเซลล์ทรงกระบอกที่มีนิวเคลียสขนาดใหญ่ น้ำหนักเบา รูปร่างปกติ และนิวคลีโอลัสหลายตัว การเชื่อมต่อแบบเดสโมโซมระหว่างเซลล์และกับเยื่อฐานแสดงออกมาอย่างชัดเจน ใต้เยื่อฐานที่กำหนดอย่างชัดเจน ซึ่งมีการเจริญเติบโตเล็กน้อยในชั้นใต้หนังกำพร้า ขนานกับเยื่อฐานนั้นมีมัดเส้นใยคอลลาเจนและอีลาสตินที่บอบบาง ซึ่งมีไฟโบรบลาสต์ยาว หลอดเลือดขนาดเล็ก ในชั้นที่ลึกกว่านั้น มัดเส้นใยคอลลาเจนและอีลาสตินจะวางตัวในทิศทางที่ต่างกัน ในจำนวนนี้ มีหลอดเลือดจำนวนมากที่มีผนังบางที่มีขนาดเท่ากัน องค์ประกอบของเซลล์ (ไฟโบรบลาสต์ เซลล์มาสต์ เม็ดเลือดขาว) รูขุมขนจำนวนมาก ต่อมไขมัน

ชุดควบคุม2.แผลเป็นจากหนู อายุ2 เดือน

ภาพทางคลินิก แผลเป็นสีชมพูซีด ลอก มีสะเก็ดบางจุด พื้นที่แผลลดลงเนื่องจากการหดตัวของเส้นใยคอลลาเจน เหลือประมาณ 3.0-3.5 ซม^.ไม่มีส่วนประกอบของผิวหนัง

ภาพจุลทรรศน์ ชั้นหนังกำพร้าประกอบด้วยเซลล์ 3-5 ชั้นที่พับเป็นชั้นฐานกลม แถวหนึ่งเป็นเซลล์ซับเลต แถวหนึ่งเป็นเซลล์เม็ดเล็กที่มีเมล็ดเคอราโทไฮยาลินอยู่ด้านบน 1-2 แถวมีอาการบวมน้ำภายในเซลล์ ชั้นหนังกำพร้าเปลี่ยนแปลงจากบางมากเป็นหนาขึ้นอย่างไม่สม่ำเสมอ แผลเป็นพับเกิดขึ้นเนื่องจากเนื้อเยื่อแผลเป็น (การหดตัว) รอยพับทะลุชั้นปุ่มและสร้างรอยหยักของปุ่ม ขอบเขตระหว่างหนังกำพร้าและหนังแท้เป็นเส้นตรง เยื่อฐานไม่ปรากฏให้เห็นทุกที่ ในส่วนล่างของชั้นใต้หนังกำพร้าและชั้นที่ลึกกว่ามีหลอดเลือดที่มีผนังหนาและคลายตัว หลายหลอดเลือดว่างเปล่าและมีการคั่งค้าง รอบๆ หลอดเลือดมีการสะสมของแมคโครฟาจหรือไฟโบรบลาสต์ แมคโครฟาจล้อมรอบเม็ดเลือดแดงที่ปล่อยออกมาจากเส้นเลือดฝอยและดูดกลืนพวกมัน ในชั้นผิวเผินจะมีเส้นเลือดฝอยเล็กๆ อยู่ใต้หนังกำพร้าจะมีเส้นใยคอลลาเจนอยู่หลวมๆ ในชั้นที่ลึกกว่าของแผลเป็นจะมีเส้นใยคอลลาเจนที่เป็นกลุ่มใหญ่ ซึ่งมีไฟโบรบลาสต์อยู่จำนวนมาก

แผลเป็นจากหนู 1 เดือนหลังจากการปลูกถ่ายเซลล์เคราตินในหนู

ภาพทางคลินิก แผลเป็นสีชมพู พื้นที่แผลเล็กลง โดยเฉพาะเส้นผ่านศูนย์กลาง โดยเฉลี่ยมีขนาด 2.5-3 ซม. ²ต่อมขนและไขมันหายไป

ข้อมูลที่ได้จากการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ของวัสดุที่ได้จากหนูที่มีการปลูกถ่าย MPaLK บนแผ่นฟิล์มและ MPaLK โดยไม่ใส่สารตั้งต้นนั้นแทบจะเหมือนกันทุกประการ อย่างไรก็ตาม การทำงานกับ MPaLK โดยไม่ใส่สารตั้งต้นนั้นซับซ้อนและต้องใช้ความพยายามมากกว่าการปลูก MPaLK บนพื้นผิวมาก ดังนั้น ในการศึกษาประเด็นการปลูกถ่ายเซลล์เคอราติโนไซต์บนแผลเป็นเพิ่มเติม เราจึงใช้แคมบริกหลายชั้นเป็นพื้นฐานสำหรับการปลูกถ่าย ("สารตั้งต้น")

ภาพจุลทรรศน์ สังเกตการหนาขึ้นของชั้นหนังกำพร้าเป็น 15-20 ชั้น โดยเกือบถึงตรงกลาง เซลล์เคราตินจะมีรูปร่างแนวตั้งแคบยาวและเรียงตัวกันหนาแน่น เซลล์ฐานจะเรียงตัวกันเป็นแนวไม่เท่ากัน นิวเคลียสของพวกมันมีน้ำหนักเบา ใหญ่ กลม มีนิวคลีโอลัสหนึ่งหรือสองอัน ซึ่งบ่งบอกถึงกิจกรรมการสังเคราะห์และการแบ่งตัวที่สูง ขอบเขตระหว่างหนังกำพร้าและหนังแท้เป็นเส้นตรง ชั้นสไปโนสพัฒนาอย่างดี ประกอบด้วยเซลล์กลม 3-5 ชั้น มีเซลล์นิวคลีโอลัส 2 อัน

ใต้เยื่อฐานโดยตรงมีมัดเส้นใยคอลลาเจนบาง ๆ อยู่หนาแน่น ขนานกับมัดเส้นใยเหล่านี้มีหลอดเลือดร้างจำนวนมาก เส้นใยคอลลาเจนที่ลึกกว่าจะหยาบกว่าและรวมกันเป็นมัดหนาแน่น ไฟโบรบลาสต์ขนาดใหญ่จำนวนมาก เซลล์มาสต์ (2-3 เซลล์ในระยะการมองเห็น) แมคโครฟาจ เม็ดเลือดขาว และหลอดเลือดร้างซึ่งผนังคลายตัว รอบๆ เซลล์เหล่านี้มีเส้นใยคอลลาเจนที่ตั้งอยู่หลวม ๆ ในหลอดเลือดบางชนิดมีการหยุดนิ่งหรือการแยกตัวขององค์ประกอบที่เกิดขึ้น รอบๆ หลอดเลือดมีไฟโบรบลาสต์ ลิมโฟไซต์เดี่ยว ไม่มีส่วนประกอบของผิวหนัง

เมื่อทำการปลูกถ่ายเซลล์เคราตินที่แขวนลอยอยู่บนแผลเป็นที่ขัดแล้ว ภาพจุลทรรศน์จะแตกต่างจากภาพก่อนหน้านี้ ในสัตว์ส่วนใหญ่ หนังกำพร้าจะบางและประกอบด้วยเซลล์ 5-6 ชั้น ชั้นล่างประกอบด้วยเซลล์ที่มีรูปร่างหลายเหลี่ยมไม่สม่ำเสมอพร้อมนิวเคลียสที่มีรูปร่างกลมหรือไม่สม่ำเสมอ สถานะของชั้นใต้หนังกำพร้าจะคล้ายกับสถานะของกลุ่มสัตว์ที่ไม่ได้รับการปลูกถ่าย MPALK

ในกรณีนี้ เราอาจพูดถึงความล่าช้าของกระบวนการที่เกิดขึ้นพร้อมกับการปลูกถ่ายเซลล์ หรือการสูญเสียเซลล์จำนวนมากที่ปลูกถ่ายในรูปแบบของสารแขวนลอย ดังนั้น จึงสรุปได้ว่าการแก้ไขแผลเป็นโดยการปลูกถ่ายเซลล์เคราติโนไซต์ในรูปแบบของสารแขวนลอยนั้นไม่มีประสิทธิภาพ

แผลเป็นจากหนู 2 เดือนหลังจากการปลูกถ่ายเซลล์เคราตินในหนู

ภาพทางคลินิก แผลเป็นดูบางและบอบบาง ในบางจุดมีรอยลอกและเป็นสะเก็ด

ภาพจุลทรรศน์ ชั้นหนังกำพร้าหนาขึ้นในบางจุดเรียกว่า hyperkeratosis หนังกำพร้าหนาขึ้นประกอบด้วยเซลล์ 12-20 แถว ขอบระหว่างหนังกำพร้าและหนังแท้เป็นเส้นตรง เส้นใยคอลลาเจนที่บอบบางอยู่ใต้หนังกำพร้าค่อนข้างหนาแน่น ในชั้นที่ลึกกว่าของแผลเป็น เส้นใยเหล่านี้จะถูกเก็บรวบรวมไว้เป็นกลุ่มใหญ่และหยาบ ในชั้นใต้หนังกำพร้า หลอดเลือดใหม่จะปรากฏขึ้น ในชั้นล่างของเนื้อเยื่อแผลเป็น มีหลอดเลือดร้างจำนวนมากที่ขนานกับพื้นผิวของหนังกำพร้า ไฟโบรบลาสต์ขนาดใหญ่กระจายอย่างสม่ำเสมอในความหนาของแผลเป็น มีแมคโครฟาจขนาดใหญ่ที่มีหลายกิ่งก้านจำนวนมาก

แผลเป็นในหนู 5 เดือนหลังการปลูกถ่ายเซลล์ผิวหนังของหนู

ภาพทางคลินิก แผลเป็นดูเรียบเนียน ไม่ลอก มีขนเส้นเดียว ความหนาแน่นของขนบริเวณรอบแผลเป็นมากขึ้น แสดงว่ารูขุมขนขยายเข้าไปในแผลเป็นและมีรูขุมขนใหม่เกิดขึ้น แผลเป็นบริเวณที่ลดลงเรื่อยๆ

ภาพจุลทรรศน์ หนังกำพร้ายังคงหนาอยู่ (15-20 ชั้น บางแห่งถึง 30 ชั้น) ในชั้นบนเต็มไปด้วยเมล็ดเคราโตไฮยาลิน มองเห็นเยื่อฐานได้ชัดเจน ใต้เยื่อนี้มีเส้นใยคอลลาเจนอยู่หลวมๆ ในชั้นล่าง คอลลาเจนแข็งแรงและแน่นกว่า มีเส้นเลือดฝอยจำนวนมากอยู่ท่ามกลางมัดคอลลาเจน ในชั้นบน จำนวนของหลอดเลือดที่รกร้างลดลง จุดเชื่อมต่อระหว่างหนังกำพร้าและหนังแท้เป็นคลื่นเล็กน้อย ในบางสถานที่ มีการเจริญเติบโตของหนังกำพร้าที่ลึกในเนื้อเยื่อแผลเป็น หลอดเลือดที่เพิ่งก่อตัวขึ้นสามารถมองเห็นได้ท่ามกลางเส้นใยคอลลาเจน รูขุมขนเดี่ยวและต่อมไขมันปรากฏขึ้น

แผลเป็นในหนู 9 เดือนหลังจากการปลูกถ่ายเซลล์ MPA บนผิวหนังของหนู

ภาพทางคลินิก แผลเป็นมีขนาดเล็กลงอย่างเห็นได้ชัดเมื่อเทียบกับช่วงก่อน พื้นที่แผลโดยเฉลี่ยอยู่ที่ประมาณ 1.5-2.0 ซม. ²แผลเป็นถูกปกคลุมอย่างไม่สม่ำเสมอด้วยขนละเอียด โดยเฉพาะบริเวณรอบนอก ยังคงมีการลอกเป็นแผ่นบางๆ เล็กน้อย

ภาพจุลทรรศน์

หนังกำพร้าบางลงแสดงด้วยเซลล์ 6-8 แถว โครงสร้างคล้ายกับหนังกำพร้าของหนูปกติ มีเพียงความหนาแน่นของเซลล์สูงกว่า 1 มม. และมีขนาดเล็กกว่า ชั้นฐานประกอบด้วยเซลล์ทรงกระบอกกลมเล็ก ๆ เยื่อฐานแสดงออกได้ดี มองเห็นเฮมิเดสโมโซมได้ชัดเจน สังเกตเห็นการเจริญเติบโตของหนังกำพร้าในชั้นใต้หนังกำพร้า ชั้นปุ่มแสดงออกมาตลอดความยาวของแผลเป็น ข้อเท็จจริงเหล่านี้บ่งชี้ว่าในเวลานี้การยึดเกาะของเคอราติโนไซต์ที่ปลูกถ่ายมีความแข็งแรงมากขึ้นด้วยเนื้อเยื่อแผลเป็นที่อยู่ด้านล่าง ดังนั้นการดูแลแผลเป็นในผู้ที่ได้รับการปลูกถ่าย MPALK 9 เดือนหลังการปลูกถ่าย MPC จึงสามารถใช้แบบดั้งเดิมได้ ใต้หนังกำพร้า เส้นใยคอลลาเจนจะบอบบางกว่าในชั้นลึก มีหลอดเลือดจำนวนมากปรากฏขึ้น โดยเฉพาะหลอดเลือดผิวเผิน ผนังของหลอดเลือดขนาดใหญ่จะหนาขึ้น รูขุมขนและต่อมไขมันมีอยู่ในปริมาณมาก ภาพจุลทรรศน์มีลักษณะเหมือนเนื้อเยื่อคล้ายชั้นหนังแท้

ผลการทดลองและการอภิปรายผล

ในระหว่างการทำงานนี้ เซลล์เคอราติโนไซต์ในรูปแบบต่างๆ จะถูกปลูกถ่ายลงบนแผลเป็นบนผิวหนังของหนูที่สร้างขึ้นโดยเทียมหลังการผ่าตัดขัดผิวด้วยเครื่องขัดผิว โดยปลูกถ่ายบนแผ่นปิดแผล โดยปลูกถ่ายบนผ้าแคมบริก และปลูกถ่ายเป็นชั้นหลายชั้นโดยไม่มีสารตั้งต้น การทำงานนี้ดำเนินการด้วยจุดมุ่งหมายเพื่อให้ได้ข้อมูลทางสัณฐานวิทยาเกี่ยวกับผลกระทบของเซลล์เคอราติโนไซต์ที่ปลูกถ่ายต่อแผลเป็น ตลอดจนเพื่อกำหนดทางเลือกในการปลูกถ่ายที่เหมาะสมที่สุด

พบว่าวิธีการปลูกถ่ายทั้งสามวิธีสามารถทำได้ แต่การปลูกถ่าย MPAC โดยไม่ใช้สารตั้งต้นเป็นขั้นตอนที่ต้องใช้แรงงานมาก ซึ่งในระหว่างนั้น MPAC อาจได้รับบาดเจ็บ ซึ่งจะส่งผลต่อผลการปลูกถ่าย นอกจากนี้ วิธีปลูกถ่ายนี้ยังไม่ต้องทำงานบนพื้นผิวขนาดใหญ่

การปลูกถ่ายเซลล์แขวนลอยเคราตินเป็นวิธีที่คุ้มทุนกว่ามาก ไม่จำเป็นต้องเพาะเลี้ยงเซลล์ในระยะยาว และง่ายในเวอร์ชันที่เราเสนอโดยใช้แผ่นแคมบริกปลอดเชื้อที่มีขนาดสอดคล้องกับขนาดของแผลเป็น การล่าช้าของผลการรักษาเมื่อปลูกถ่ายเซลล์แขวนลอยประมาณหนึ่งเดือนเมื่อเทียบกับ MPC บนชั้นเคลือบแผลไม่ใช่จุดสำคัญเมื่อต้องใช้เวลารักษาหลายเดือน เป็นที่ทราบกันดีว่าเมื่อปลูกถ่าย MPC ให้กับผู้ป่วยไฟไหม้ การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างผิวหนังจะเกิดขึ้นอย่างค่อยเป็นค่อยไปและใช้เวลานานหลายปี การปลูกถ่ายเซลล์แขวนลอยเคราตินบนชั้นเคลือบแผลเป็นวิธีที่สะดวกและมีแนวโน้มมากที่สุด แต่ก็มีราคาแพงกว่ามาก นอกจากนี้ ปัจจุบันยังต้องค้นหาวิธีการเคลือบขั้นสูงที่ยืดหยุ่น ดูดความชื้น มีคุณสมบัติในการยับยั้งแบคทีเรียหรือฆ่าเชื้อแบคทีเรีย และเป็นกลางทางชีวภาพสำหรับเซลล์ ฟิล์ม "Polypor" ซึ่งเป็นฟิล์มปิดแผลในประเทศเวอร์ชันกลาง แม้จะมีข้อบกพร่องบางประการ แต่ก็ช่วยให้เราศึกษาการทดลองการปลูกถ่ายเซลล์เคอราติโนไซต์ของหนูบนรอยแผลเป็น และสรุปประสิทธิผลของการรักษารอยแผลเป็นวิธีนี้ได้

ผู้เขียนที่ปลูกถ่าย MPC ลงบนแผลไฟไหม้สังเกตว่าในช่วงสัปดาห์แรกหลังจากปลูกถ่ายชั้นเคอราติโนไซต์หลายชั้นบนแผลที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว หนังกำพร้าจะหนาขึ้นและแยกชั้นออก ชั้นหนังกำพร้าทั้งหมดมองเห็นได้ชัดเจน ที่น่าสนใจคือ จำนวนชั้นเซลล์ในการปลูกถ่ายนั้นมากกว่าในชิ้นเนื้อผิวหนัง 10-30% ผู้เขียนสังเกตเห็นการปรากฏของเม็ดเคอราโทไฮยาลินในวันที่ 5 หลังจากการปลูกถ่าย MPC และเยื่อฐานและเฮมิเดสโมโซม - ในวันที่ 3 แล้ว

J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) พบว่าในระยะเริ่มต้นหลังจากการปลูกถ่าย MPC ให้กับผู้ป่วยที่มีข้อบกพร่องของผิวหนังเต็มความหนาหลังจากถูกไฟไหม้ การเชื่อมต่อระหว่างชั้นหนังแท้และหนังกำพร้าจะอ่อนมากและเป็นเส้นตรง ชั้นปุ่มจะไม่มีอยู่ เมื่อสิ้นสุดเดือนที่ 2 ปุ่มตื้นและส่วนต่อขยายของผิวหนังจะเริ่มก่อตัวขึ้น การเชื่อมต่อระหว่างชั้นหนังแท้และหนังกำพร้าจะแข็งแรงขึ้น ข้อมูลจากเอกสารระบุว่าการปลูกถ่ายเคอราติโนไซต์จากคนอื่นบนบาดแผลในผู้ป่วยไฟไหม้เป็นวิธีที่มีแนวโน้มดี แม้ว่าเคอราติโนไซต์จากคนอื่นจะปฏิเสธ แต่ตามที่ผู้เขียนหลายคนกล่าวไว้ ภายใน 10 วันถึง 3 เดือน เซลล์เหล่านี้ก็ยังคงมีบทบาทในการรักษาพื้นผิวแผล หลั่งปัจจัยการเจริญเติบโต และปิดข้อบกพร่องด้วยกลไก เชื่อกันว่า MPALC มีกิจกรรมแอนติเจนที่ลดลง เนื่องจากในระหว่างการเพาะเลี้ยงในหลอดทดลอง เซลล์ดังกล่าวจะสูญเสียเซลล์ Langerhans ซึ่งทำให้เซลล์เหล่านี้สามารถดำรงอยู่ในร่างกายของผู้รับได้เป็นเวลานาน นอกจากนี้ การเพาะเลี้ยงแบบอัลโลจีเนอิกที่ได้จากผิวหนังของคนหนุ่มสาวที่แข็งแรงยังมีศักยภาพทางชีวภาพที่มากกว่าการเพาะเลี้ยงแบบออโตโลกัสของผู้ป่วยหลังจากได้รับบาดเจ็บอย่างไม่มีใครเทียบได้

เป้าหมายหลักของการศึกษาของเราคือการค้นหาว่าเซลล์เคอราติโนไซต์จากต่างสายพันธุ์จะฝังรากลงในแผลเป็นหรือไม่ และจะมีการเปลี่ยนแปลงอะไรเกิดขึ้นกับเนื้อเยื่อแผลเป็นภายใต้อิทธิพลของ "สารเคลือบแผล" ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพดังกล่าว ในกรณีที่ได้ผลบวก ให้พัฒนาเทคโนโลยีที่มีประสิทธิภาพสูงสุดและใช้แรงงานน้อยที่สุดสำหรับสาขาเวชศาสตร์ฟื้นฟูนี้

ข้อมูลที่เราได้รับนั้นมีความคล้ายคลึงกับข้อมูลวรรณกรรมในหลายๆ ด้านเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาที่เกิดขึ้นในหนังกำพร้าของมนุษย์หลังจากการปลูกถ่ายเคอราติโนไซต์จากแหล่งอื่นเพื่อบาดแผลไฟไหม้ อย่างไรก็ตาม ยังมีความแตกต่างที่สำคัญทั้งในแง่ของพื้นผิวทางสัณฐานวิทยาที่การปลูกถ่ายเกิดขึ้นและในแง่ของเทคโนโลยี ดังนั้น กระบวนการสร้างเยื่อฐานและการเชื่อมต่อระหว่างชั้นหนังแท้กับหนังกำพร้า (เฮไมเดสโมโซม, ปุ่มเนื้อหนัง) จะเกิดขึ้นในระยะหลังเมื่อเปรียบเทียบกับการปลูกถ่ายเคอราติโนไซต์ไปยังพื้นผิวของแผลที่ไม่มีการเปลี่ยนแปลงของแผลเป็น เห็นได้ชัดว่าสิ่งนี้เกิดขึ้นเนื่องจากเนื้อเยื่อแผลเป็นได้รับสารอาหารน้อยกว่าเมื่อเทียบกับชั้นหนังแท้หรือพังผืดของกล้ามเนื้อ แผลเป็น โดยเฉพาะแผลเก่าเป็นเนื้อเยื่อเกี่ยวพันหนาแน่นที่มีหลอดเลือดจำนวนน้อยมาก ในขณะที่ส่วนล่างของแผลไฟไหม้เป็นเนื้อเยื่อเม็ดเลือดที่มีหลอดเลือดจำนวนมาก ดังนั้น จึงเป็นที่ชัดเจนว่าเงื่อนไขในการปลูกถ่ายและฝังเคอราติโนไซต์นั้นแตกต่างกันโดยสิ้นเชิง ยิ่งบริเวณที่ปลูกถ่ายเซลล์มีหลอดเลือดมากเท่าไร กระบวนการปลูกถ่ายเซลล์ก็จะง่ายขึ้นเท่านั้น จากสมมติฐานนี้ ข้อสรุปเกี่ยวกับความชอบในการทำงานกับแผลเป็นที่ยังอายุน้อย ซึ่งเนื้อเยื่อเกี่ยวพันยังค่อนข้างหลวมและมีหลอดเลือดมาก

จากผลงานการทดลองนี้พิสูจน์ได้ว่า:

1. การปลูกถ่าย MPALK ลงบนรอยแผลเป็นเป็นไปได้
2. วิธีการปลูกถ่ายที่ดีที่สุดคือการปลูกถ่ายเซลล์เคอราติโนไซต์ไปบนชั้นปิดแผล
3. ควรขัดพื้นผิวแผลเป็นโดยใช้การขัดผิวด้วยเลเซอร์หรือเครื่องตัดชูมันน์
4. ภายใต้อิทธิพลของ MPALK การเกิดเซลล์เยื่อบุผิวอย่างรวดเร็วบนพื้นผิวที่ขัดเงาของแผลเป็นจะเกิดขึ้น
5. ยิ่งเนื้อเยื่อแผลเป็นมีหลอดเลือดมากเท่าไร นั่นคือ ยิ่งแผลเป็นมีอายุน้อยเท่าไร ผลลัพธ์ของการปลูกถ่ายเซลล์เคราตินก็จะดีมากขึ้นเท่านั้น
6. ภายใต้อิทธิพลของเซลล์เคอราติโนไซต์ที่ถูกปลูกถ่าย เนื้อเยื่อแผลเป็นจะค่อยๆ เปลี่ยนแปลงและกลายเป็นเนื้อเยื่อคล้ายชั้นหนังแท้ (มีเนื้อเยื่อแผลเป็นหลวมๆ พร้อมส่วนประกอบของผิวหนัง)
7. เนื้อเยื่อแผลเป็นจะค่อยๆ คลายตัวลง โดยเริ่มจากชั้นใต้ผิวหนัง หลอดเลือดจะดีขึ้น เส้นใยคอลลาเจนในส่วนบนและส่วนล่างของแผลเป็นจะเรียงตัวกันหลวมกว่าเนื้อเยื่อแผลเป็นที่ไม่ได้ปลูกถ่ายเซลล์ รูขุมขนและต่อมไขมันจะปรากฏขึ้น หนังกำพร้าซึ่งผ่านระยะไฮเปอร์โทรฟีในโครงสร้างแล้ว จะเข้าใกล้หนังกำพร้าของผิวหนังปกติ
8. การเปลี่ยนแปลงที่สังเกตได้นั้นเกี่ยวข้องกับปัจจัยการเจริญเติบโตและไซโตไคน์ที่หลั่งออกมาจากเซลล์เคอราติโนไซต์ ซึ่งเมื่อปรับปรุงการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อแผลเป็นแล้ว จะส่งเสริมการเปลี่ยนแปลงจากเนื้อเยื่อเส้นใยหยาบไปเป็นเนื้อเยื่อที่หลวมขึ้น ซึ่งนำไปสู่การปรับปรุงลักษณะของแผลเป็น

ดังนั้น จากการศึกษาครั้งนี้สามารถสรุปได้ว่า การปลูกถ่ายเซลล์เคอราติโนไซต์มีผลดีต่อเนื้อเยื่อแผลเป็น ซึ่งอาจมีความหมายในทางปฏิบัติต่อการฟื้นฟูผู้ป่วยที่มีแผลเป็นประเภทต่างๆ

งานวิจัยเกี่ยวกับหนูนี้ยังทำให้เราสามารถกำหนดข้อกำหนดสำหรับสิ่งปกคลุมแผลที่เซลล์เคราติโนไซต์จะเจริญเติบโตได้

แผ่นปิดแผลควรมีลักษณะดังนี้:

• เข้ากันได้กับเซลล์
• ระบายอากาศได้,
• มีฐานยืดหยุ่นสร้างรูปร่างได้
• มีคุณสมบัติชอบน้ำ
• เนื่องจากสารเติมแต่งทางยาประกอบด้วยสารต่อต้านแบคทีเรียและสารต้านอนุมูลอิสระซึ่งไม่เป็นพิษต่อเซลล์ที่เพาะเลี้ยง

ผลลัพธ์ทางคลินิกของการรักษาแผลเป็นด้วยเทคโนโลยีชีวภาพ

ก่อนหน้านี้ N. Carver et al. (1993) พบว่าแผ่นปิดแผลแบบอุดตันช่วยส่งเสริมการเกาะติดกับแผลและการอยู่รอดของเซลล์เคราตินได้ดีที่สุด แต่ไม่อนุญาตให้เกิดการสร้างชั้นหนังกำพร้าแบบแบ่งชั้น (โตเต็มที่) สภาพแวดล้อมที่มีอากาศเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการสร้างชั้นหนังกำพร้าแบบแบ่งชั้น ดังนั้น หลังจากการเกาะติดของชั้นหลายชั้นแล้ว จึงมีข้อเสนอให้เอาแผ่นปิดแผลแบบอุดตันออกหลังจาก 7-10 วัน และรักษาแผลโดยใช้แผ่นปิดแผลแบบแห้งหรือขี้ผึ้งละลายน้ำได้ อาจกล่าวได้ว่าคุณภาพและคุณสมบัติของ "สารตั้งต้น" ที่เซลล์เจริญเติบโตเป็นจุดสำคัญมากต่อประสิทธิภาพของการปลูกถ่ายวัสดุเซลล์ และด้วยเหตุนี้จึงส่งผลต่อผลงานของแพทย์ด้วย แต่ปัจจุบันยังไม่มีแผ่นปิดแผลในอุดมคติ แม้จะมีทางเลือกอื่นๆ มากมายที่เสนอไว้ (ผิวหนังเทียม ผ้าไม่ทอที่ทำจากคาร์บอกซีเมทิลเซลลูโลส สารเคลือบไฟบริน ฟิล์มโพลียูรีเทนแบบกึ่งซึมผ่านได้) ประเด็นสำคัญในเรื่องนี้คือค่าใช้จ่ายของ “สารตั้งต้น” (วัสดุปิดแผลชนิดพิเศษ) เนื่องจากต้นทุนที่สูงทำให้ต้นทุนโดยรวมของการรักษาด้วยเทคโนโลยีชีวภาพเพิ่มขึ้น

ประสิทธิภาพของเทคโนโลยีเซลล์ได้รับการพิสูจน์แล้วจนถึงปัจจุบัน แต่น่าเสียดายที่เทคโนโลยีเหล่านี้มีราคาแพงมาก โดยเฉพาะในประเทศที่ยังไม่มีการผลิตเซลล์ในรูปแบบอุตสาหกรรม อย่างไรก็ตาม ประเทศต่างๆ เช่น สหรัฐอเมริกา ได้ก่อตั้งอุตสาหกรรมการผลิตวัสดุเซลล์สำหรับการปลูกถ่ายแผลไฟไหม้มาเป็นเวลานาน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ตั้งแต่ปี 1989 บริษัท BioSurface Technology Inc. ได้เพาะเลี้ยงเซลล์เคราตินหลายชั้นจำนวน 37,000 ชั้น ซึ่งใช้ในการรักษาผู้ป่วย 240 รายใน 79 ประเทศทั่วโลก (R. Odessey, 1992) ในขณะที่^{เซลล์}เพาะเลี้ยงขนาด 1 ตร.ซม. มีราคาอยู่ที่ประมาณ 7-8 เหรียญสหรัฐ

เทคโนโลยีในการรักษาโรคและปัญหาผิวหนังต่างๆ มีความแตกต่างอยู่หลายประการ แต่การบำบัดเซลล์ใดๆ ก็ตามจะขึ้นอยู่กับการได้รับวัสดุเซลล์ที่มีคุณภาพสูงและการปลูกถ่ายวัสดุดังกล่าว

กระบวนการนี้ประกอบด้วยขั้นตอนต่อไปนี้:

• การนำผิวหนังจากเหยื่อ (หรือจากผู้บริจาค)
• การขนย้ายแผ่นผิวหนังไปยังศูนย์เทคโนโลยีชีวภาพ
• การแยกเซลล์ชั้นฐานและการแพร่กระจายของเซลล์
• การเจริญเติบโตของชั้นเคราตินไซต์หลายชั้น (MLK)
• การปลูกถ่ายเซลล์เพาะเลี้ยง

ปัญหาหลักในการทำการรักษาโดยใช้การปลูกถ่ายแผ่นเคอราติโนไซต์หลายชั้นคือความต้องการเซลล์ที่มีชีวิตในทุกขั้นตอนของการปลูกถ่ายเซลล์ ชิ้นส่วนของผิวหนังสำหรับแยกเซลล์ของตัวเองหรือเซลล์จากคนอื่นควรมีความบางที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ เนื่องจากในกรณีนี้จะแยกได้ง่ายขึ้นโดยใช้วิธีการทางกลไกและเอนไซม์ และทำให้ได้เซลล์ที่มีชีวิตแขวนลอยสำหรับการเพาะเลี้ยง เซลล์เหล่านี้สามารถตัดออกได้ด้วยเครื่อง Dermatome หรือใช้ผิวหนังของเปลือกตา หนังหุ้มปลาย และผิวด้านในของไหล่ เนื่องจากเซลล์เหล่านี้มีความไวต่อฮาโลเจน (คลอรีน ไอโอดีน) และไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ จึงไม่สามารถใช้เซลล์เหล่านี้ในการประมวลผลผิวหนังระหว่างการรวบรวมวัสดุได้

ปริมาณและคุณภาพของเซลล์ที่ได้จากการปลูกถ่ายผิวหนังและประสิทธิภาพของการเพาะเลี้ยงเซลล์ยังขึ้นอยู่กับสุขภาพและอายุของผู้บริจาคด้วย นอกจากนี้ จะต้องส่งชิ้นเนื้อผิวหนังให้เร็วที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้และภายใต้เงื่อนไขที่เหมาะสม (สภาพแวดล้อม อุณหภูมิ) ไปยังห้องปฏิบัติการที่ได้รับการรับรองและรับรองสำหรับจุดประสงค์ดังกล่าว

สำหรับการจัดเก็บและขนส่งแผ่นหนัง สามารถใช้ Eagle's Medium หรือ Medium 199 ที่เติมซีรั่มจากวัว 10% หรือ DMEM Medium ที่เติมซีรั่มจากวัวตัวอ่อน 5% และยาปฏิชีวนะได้

ในห้องปฏิบัติการเซลล์วิทยา ชิ้นเนื้อผิวหนังจะถูกแบ่งออกทางกลไกเป็นชิ้นเล็ก ๆ ก่อน จากนั้นชิ้นส่วนผิวหนังจะถูกประมวลผลโดยใช้เอนไซม์ เช่น ทริปซิน คอลลาจิเนส ไดเพส ฯลฯ

ภายใต้การกระทำของเอนไซม์ เดสโมโซมจะถูกทำลายและเคอราติโนไซต์จะถูกปล่อยลงในอาหารเลี้ยงเชื้อในรูปแบบของเซลล์เดี่ยวหรือกลุ่มที่ประกอบด้วยเซลล์จำนวนต่างกัน เฉพาะเคอราติโนไซต์พื้นฐานเท่านั้นที่ใช้สำหรับการเพาะเลี้ยง ซึ่งเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อพิเศษในเทอร์โมสแตทที่มี CO 5% ในจานเพาะเชื้อหรือในขวดที่อุณหภูมิ 37 °C หลังจากผ่านไป 48 ชั่วโมง จะสังเกตเห็นการก่อตัวของโคโลนีของเคอราติโนไซต์ ซึ่งค่อยๆ รวมตัวกันเพื่อเปลี่ยนเป็นโมโนเลเยอร์ หลังจากได้รับเซลล์ในจำนวนที่เพียงพอแล้ว สารแขวนลอยที่ได้จะถูกหว่านลงบนแผ่นปิดแผลที่เตรียมไว้สำหรับจุดประสงค์นี้และวางไว้ในจานเพาะเชื้อ ขั้นแรก จะเกิดโมโนเลเยอร์และชั้นเคอราติโนไซต์หลายชั้นจากสารแขวนลอยนี้ ขั้นตอนของกระบวนการเพาะเลี้ยงเคอราติโนไซต์แสดงไว้โดยแผนผังในรูปที่ 12 (33,43,54,65)

การสร้างชั้นเคอราติโนไซต์หลายชั้นที่เหมาะสมสำหรับการปลูกถ่ายมักใช้เวลา 7-10 วัน บางครั้งระยะเวลานี้อาจนานกว่านั้น ซึ่งขึ้นอยู่กับคุณภาพของวัสดุต้นทาง (อายุ สภาพสุขภาพของผู้บริจาค ความถูกต้องของการรวบรวมวัสดุ คุณภาพของสื่อที่ใช้ ฯลฯ) หากชั้นเคอราติโนไซต์หลายชั้นเติบโตมากเกินไป เซลล์ที่มีอาการอะพอพโทซิสซึ่งไม่เหมาะสำหรับการปลูกถ่ายอาจปรากฏขึ้นบนพื้นผิว จานเพาะเชื้อที่มีชั้นเคอราติโนไซต์หลายชั้น (MLK) ที่ปลูกบนแผ่นปิดแผลจะถูกส่งไปยังคลินิกในภาชนะพิเศษที่อุณหภูมิอย่างน้อย +15° C

วิธีปลูก MPC แบบดัดแปลงของกรีน

ในการทำงานของเรา เราใช้แคมบริกหลายชั้นเป็นวัสดุคลุมแผล โดยละทิ้งฟิล์ม "โพลีพอร์" ที่เราใช้เริ่มใช้ในการทดลองกับหนู ดังนั้น เราจึงปลูกชั้นเคอราติโนไซต์หลายชั้นบนแคมบริกที่กำจัดไขมันออกแล้วและผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว แม้ว่าจะไม่ใช่วัสดุคลุมแผลที่เหมาะสมที่สุดก็ตาม

มีการดำเนินการศึกษาทางคลินิกกับอาสาสมัครโดยปฏิบัติตามมาตรฐานทางจริยธรรมที่จำเป็น: การลงนามในข้อตกลงและการยินยอมโดยแจ้งให้ทราบ

1. มีการใช้การเพาะเลี้ยงเซลล์เคอราติโนไซต์ของผู้ป่วยเอง (เซลล์ต้นกำเนิดของตัวเอง) และเซลล์เคอราติโนไซต์ที่เก็บรักษาไว้ (เซลล์ต้นกำเนิดจากผู้อื่น)
2. เซลล์เคอราติโนไซต์ของคนไข้เองได้มาจากชิ้นส่วนผิวหนังที่ตัดจากด้านในของต้นแขน
3. การผ่าตัดกรอผิวเป็นแผลเป็นทำได้โดยใช้การจี้ด้วยความร้อน ดิสก์หมุน และเลเซอร์เออร์เบียม
4. กลุ่มผู้ป่วยที่มีแผลเป็นปกติ แผลเป็นน้อย และแผลเป็นมาก ถูกนำมาใช้

กระบวนการทางเทคโนโลยีในการประยุกต์ใช้เทคโนโลยีเซลล์เพื่อปรับปรุงลักษณะของรอยแผลเป็นบนผิวหนังประกอบด้วยขั้นตอนต่อไปนี้:

1. การคัดเลือกคนไข้
2. คำอธิบายถึงสาระสำคัญของการรักษา, กรอบเวลาสำหรับการได้รับผลลัพธ์ที่คาดหวัง, การลงนามในสัญญา และการยินยอมโดยรับทราบข้อมูล
3. กำหนดให้กับผู้ป่วย 2-3 สัปดาห์ก่อนการผ่าตัดโดยรับประทาน Selmevit ครั้งละ 1 เม็ด วันละ 3 ครั้ง, Zinctheral ครั้งละ 1 เม็ด วันละ 3 ครั้ง
4. โดยการนำชิ้นส่วนผิวหนังยาว 2.0 ซม. และกว้าง 0.7-1.0 ซม. จากผิวด้านในของไหล่ขึ้นมาเกือบถึงบริเวณรักแร้ส่วนล่าง เพื่อเก็บเซลล์เคอราติโนไซต์ของร่างกายตนเอง
5. ในกรณีที่ผู้ป่วยปฏิเสธที่จะแยกเซลล์เคอราติโนไซต์ของตนเองเนื่องจากอาจมีแผลเป็นเชิงเส้นที่ผิวด้านในของไหล่ จะมีการคัดวัสดุเซลล์จากธนาคารเซลล์ (เซลล์เคอราติโนไซต์จากผู้อื่น)
6. เซลล์เคอราติโนไซต์ถูกแยกและเพาะเลี้ยงในห้องปฏิบัติการที่ได้รับการรับรองสำหรับงานประเภทนี้
7. หลังจากได้รับ MPC ในปริมาณที่เพียงพอสำหรับการปลูกถ่ายลงบนแผลเป็นแล้ว ก็จะกำหนดวันผ่าตัดที่คลินิก โดยจะนำวัสดุมาใส่ในภาชนะพิเศษในจานเพาะเชื้อ
8. การผ่าตัดกรอผิวเป็นแผลเป็นได้ดำเนินการแล้ว โดยทำการห้ามเลือด จากนั้นล้างพื้นผิวที่ขัดแล้วด้วยน้ำเกลือที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว เช็ดให้แห้ง หลังจากนั้นจึงปลูกเซลล์ MPC ลงบนเซลล์บน "เซลล์ด้านล่าง" ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว กล่าวคือ เซลล์ที่อยู่ด้านบนในเซลล์ MPC จะอยู่ด้านล่าง โดยอยู่ติดกับพื้นผิวที่ขัดแล้ว
9. ทำการติดฟิล์มสเตอริไรล์ทับบนผิวหนัง แล้วติดไว้กับผิวหนังด้วยผ้าพันแผลแบบยืดหยุ่นหรือพลาสเตอร์ Omnifix แบบยืดหยุ่น แทนที่จะใช้ฟิล์ม สามารถใช้แผ่นปิดแผลชนิดอื่นที่มีซิลิโคนแทนได้ เช่น Mepitel, Mepiform หรือแผ่นเจลซิลิโคน

หลังจากผ่านไป 5-7 วัน แผ่นฟิล์มหรือซิลิโคนเคลือบจะถูกลอกออก เมื่อถึงเวลานี้ เซลล์เคราตินทั้งหมดน่าจะคลานไปบนแผลเป็นที่ขัดแล้วและเกาะติดกับผิวแผล

10. สภาพแวดล้อมที่ชื้นซึ่งสร้างขึ้นภายใต้ฟิล์มและการเคลือบซิลิโคนมีส่วนช่วยอย่างมากในเรื่องนี้ แคมบริกที่เหลืออยู่บนแผลเป็นจากจุดนี้เป็นต้นไปสามารถแช่ด้วยเจลคูริโอซินหรือไคโตซานได้ เป็นผลให้ในวันที่ 2 จะมีการสร้างเปลือกแข็งหนาแน่น ซึ่งเพื่อความสะดวกของผู้ป่วย ควรแก้ไขด้วยแผ่นแปะยืดหยุ่นที่ระบายอากาศได้ เช่น Omnifix เปลือกแข็งที่ระบายอากาศได้ช่วยให้หนังกำพร้าที่ก่อตัวขึ้นแยกตัวและกลายเป็นหนังกำพร้าที่โตเต็มที่

ขึ้นอยู่กับประเภทของแผลเป็นและความลึกของการเสียดสี ผ้าพันแผลจะถูกปฏิเสธหลังจาก 8-10 วัน ในช่วงเวลานี้ หนังกำพร้าจะมีชั้นเซลล์มากกว่าผิวหนังปกติ 30-40% เยื่อฐานยังไม่ก่อตัว เซลล์เคราตินในหนังกำพร้าที่หนาขึ้นจะหลั่งโมเลกุลที่ทำงานทางชีวภาพจำนวนมากเข้าไปในเนื้อเยื่อแผลเป็น

ความสำเร็จของการรักษาแผลเป็นด้วยเทคโนโลยีชีวภาพนั้นขึ้นอยู่กับวิธีการดูแลในช่วงหลังการผ่าตัดเป็นส่วนใหญ่ การเพาะเลี้ยงเซลล์เป็นวัสดุปิดแผลชนิด "อ่อนโยน" และในระยะเริ่มต้นหลังการปลูกถ่าย เซลล์ IPC สามารถลอกออกจากเนื้อเยื่อข้างใต้ได้อย่างง่ายดาย ดังนั้นผู้ป่วยจึงควรดูแลแผลเป็นอย่างระมัดระวังหลังการผ่าตัด เป็นเวลา 8-9 เดือน ห้ามถู และควรรักษาด้วยน้ำต้มเย็นอย่างเบามือ เพื่อหลีกเลี่ยงการฉีกขาดของชั้นหนังกำพร้าที่เพิ่งสร้างขึ้นใหม่ซึ่งไม่มีพันธะแน่นกับเนื้อเยื่อข้างใต้

บันทึก.

ก่อนการผ่าตัดและระหว่างการขัดผิว อนุญาตให้ใช้สารฆ่าเชื้อและสารออกซิไดเซอร์ที่มีฮาโลเจน (ไอโอโดไพโรน ซูลิโอโดไพโรน ไอโอดินอล ไอโอดิเนต คลอร์เฮกซิดีน ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์) ก่อนการปลูกถ่ายเซลล์ได้ แต่ห้ามใช้โดยเด็ดขาดเนื่องจากมีฤทธิ์ทำลายเซลล์ เมทิลีนบลูและกรีนบริลเลียนต์ยังเป็นพิษต่อเซลล์อีกด้วย

เพื่อหลีกเลี่ยงการติดเชื้อ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อต้องรักษาแผลเป็นนูน บริเวณผ่าตัดอาจใช้นีโอไมซินซัลเฟต โพลีมิกซิน หรือเจนตามัยซิน ยาเหล่านี้ไม่มีฤทธิ์ทำลายเซลล์ผิวหนัง

จากการรักษาดังกล่าว จะเกิดผล 3 ประการ

1. การปรับระดับพื้นผิวรอยแผลเป็น
2. การสร้างชั้นหนังกำพร้าใหม่ที่มีความหนาปกติอยู่ด้านบน
3. การเปลี่ยนแปลงของเนื้อเยื่อแผลเป็นเป็นเนื้อเยื่อคล้ายผิวหนังเนื่องจากการทำงานของไซโตไคน์ ปัจจัยการเจริญเติบโต และโมเลกุลที่ทำงานทางชีวภาพอื่นๆ ที่หลั่งออกมาจากเซลล์ที่ปลูกถ่ายและถูกกระตุ้นโดยเซลล์เหล่านี้ ได้แก่ เคราติโนไซต์ ไฟโบรบลาสต์ และแมคโครฟาจ

แผลเป็นจะดูจางลง มีความยืดหยุ่นมากขึ้น รูพรุนและขนอ่อนปรากฏขึ้น และสามารถฟื้นฟูเม็ดสีได้เนื่องจากมีเมลาโนไซต์อยู่ใน IPC

อย่างไรก็ตาม ข้อดีทั้งหมดของแผลเป็นเหล่านี้ไม่ได้เกิดขึ้นทันที ในเรื่องนี้ จำเป็นต้องเตือนผู้ป่วยว่ากระบวนการเปลี่ยนเนื้อเยื่อแผลเป็นเป็นเนื้อเยื่อชั้นในเกิดขึ้นอย่างช้าๆ และผลลัพธ์ที่ดีที่สุดของการรักษาดังกล่าวคาดว่าจะไม่เร็วกว่า 10-14 เดือน ทันทีหลังจากการปฏิเสธผ้าพันแผล พื้นผิวที่ขัดจะมีสีที่เด่นชัด ยิ่งขัดมากเท่าไร ยิ่งลึกมากเท่านั้น การขัดแผลเป็นแบบปกติด้วยเลเซอร์เออร์เบียมจะสังเกตเห็นความเสียหายต่อผิวหนังน้อยที่สุด สีของแผลเป็นและผิวหนังโดยรอบจะกลับคืนมาภายใน 3-8 สัปดาห์ แม้จะมีการป้องกันดังกล่าว การเกิดสีเข้มหลังการผ่าตัดก็อาจเกิดขึ้นได้ ซึ่งอาจหายไปเองภายในไม่กี่เดือน

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]